1、GB/T 18638 2002 前L一一口流行性乙呻刑ij脑内炎又称日本乙F琐早凹1脑炎(j扣ap川区F刷种l蚊媒卡料l人兽共患传专染病。成年iiI动司动j物和人常呈隐f刊u感i逃革染幼龄功物特别是马感染后可发尘脑炎症状.奸t账i际u叼乎猪l川叫1才创|起流1户也、死胎戍木j月7伊胎.公猪翠丸肿大.儿童可发生严言革鼓苦在占的脑炎。多发生于79月份。我国许多省(1们都有本病发生.特别是六七|年代，发病率最高。对人畜的健康可造成严重的威胁flt界动物卫t组织和IL!丰的资料，都采用病毒分离鉴定、免疫荧光试验、ll凝抑制成验、补体结合试验、血清中和试验等进行珍断。找l司对木病的研究报道较多，而比较常
2、用的诊断方法仍是本标准规定的病毒分离鉴定、Il疑抑制试验、补体结合试验。病毒分离鉴定适用于流行性乙型脑炎新疫区的确定和病畜的确诊。问撞免疫荧光i式验适用于口J疑流行性乙型脑炎病毒标本的快速检测和病毒分离株的初步鉴定。补体结合试验.由于补体结合抗体般在病后23周出现，5-6周达高峰.并可维持1年以:.故可适用于流行性乙明脑炎的较早期诊断和l流行病学调查，是最常用的方法。根据当时的实际需要，可任选种或两种检疫方法.以达到准确诊断的门的。丰标准的实施，对提高乙型脑炎的诊断和疫悄预测水平，及时采取防制措施，保证人畜健康，将起到重要的作用。本标准的附录A、附录B都是标准的附录。半标准出巾华人民共和国农业
3、部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。丰标准起草单位中同人民解放军农牧大学。牛L标准主要起草人李伯民、宣华、李金中、xlJ振润。131 中华人民共和国国家标准流行性乙型脑炎诊断技术GB/T 18638- 2002 Diagnostic techniques for epidemic encephalitis B 1 范围本标准规定f流行性乙理脑炎的病毒分离与鉴定、间接免疫荧光i式验、补体结合试验、血凝抑制试验等技术要求。本标准适用于门岸、产地及集散地、饲养单位(或个人)的猪、马、骤、驴、牛、平等的流行性乙型脑炎的诊断和l检疫。2 病毒的分离与鉴定2. 1 材料准备2. 1. 1 器
4、材细胞培养瓶(戎管)，吸管巾以管，王角烧瓶，37C水浴箱，37C恒温箱，普通冰箱及低温冰箱.离心机及离心管，研磨器械，普通光学显微镜，G5级玻璃滤器，孔径。45m的微孔滤膜，0.25mL 注射器放钊头c2.1.2 试剂汉克氏(Hanks)液.0.5%水解乳蛋白Ha时臼液，2万IU/mL青霉素液，2万g/mL链霉素液.7问碳酸氢纳液，1%膜蛋白酶液，1%盼红(叶性)液，伊格尔氏(Eagle)最低必要成分培养液(EMEM) .小牛血清。2. 1. 3 小动物:小鼠(6g8 g)、乳鼠。2. 1. 4 x电胚细胞、绿猴肾传代细胞(Vero)、仓鼠肾传代细胞$别。3 补体结合试验3- 1 材料准备3-
5、 ,. 1 器材试管(7.5 cm X 1. 0门时，吸管(OmL , 2 mL、1ml.)，试管架，水浴箱(37C38C:)，离心机及离心管。3- 1. 2 试剂3- 1.2.1 乙型脑炎抗原将病毒正常对照抗原，均由制标单位提供。3- 1.2.2 溶血素:由制标单位提供。效价应1 5 000以上。3.1.2.3 补体:由市j标单位提供冻于补体，或用3只以上豚鼠血清混合的新鲜补体。3- 1.2.4 绵羊红细胞2由健康绵羊采血，加人三倍的阿氏液(见附录A中A3)内，4c保存可用1个月。用前取绵丰缸细胞悬液适量，加510倍量的生理盐水(见附录A中A4)，充分混匀后，以2500 r/min 离心15
6、min，吸弃t清液后，再加生理盐水悬浮红细胞，如此洗涤3次。最后以2500 r /mm离心20min , 吸弃上清液，沉淀的主I细胞以钙揍盐水(4.1.2.7)配成1%绵羊红细胞悬液。3.1.2.5 阳性对照血清白制标单位供应。3.1.2.6 阴性对照血清由制标单位供应。3.1.2.7 钙续盐水:见附录A中AL3. 1. 3样品3.1.3.1 被检血清应于发病早期和病后4周各采血1次，分离血清，密装灭菌小瓶，4C冰箱保存或立即检查。3.1. 3- 2 采血分离血清过程应无菌操作，防止污染。血清须新鲜透明不溶血。3- 1.3.3 试验前应将阴性血清、阳性血泊、被检血清作2倍稀释，随后依动物种类进
7、行不同温度的加热灭活30min豚鼠5(，马58C 6(1 C，人、猴及小鼠60C，牛、水牛、ILJ羊、狗、猪、仓鼠62C，骤、驴63 C、64C ，家兔65C:。3. 2 操作方法3. 2. 1 预备战验见附录H(标准的附录)。3.2.2 正式试验3- 2.2.1 操作程序:a)取3排小试管，每排6支。b)于第1排的第26管内各加钙该盐水(见附录A中Al).3 mL。c) 2倍稀释的被检血清.lmL于各排第1管。d)于第l排第2管2倍稀释的被检血清Jmo. 3 mL , e) ltf，匀第l排第2管内容物，吸取Q.5 mL，分别加于第2、第3排的第2管，各加().1 ml.，加l于第1排第3管
8、余下的0.3mL , f) j，日匀第3管内容物，如上连续稀释并移入第2、第3排的相应管，直到第6管。gl结果每排形成1, 2到1, 64稀释度的被检血清，每管含稀择的被检血清0.1mL然后战表I加入二脑病毒抗尿，或正常对照抗原、钙筷盐水各0.1mL.再加2单位的补体O.2 rnL.振摇混匀后置4 (冰箱过度，取:Bm置37C水浴30min h)各管再加致敏绵羊红细胞悬液。.2mL.37C感作30min后判定。137 GB/T 18638-2002 表1正式试验滴加法m I. 。1被检血清一e士果举例致敬绵芋号(旦旦阴、阳性血工作价抗原2单位补体红细胞阳怕阴性被检被检被检清的稀释倍数血清血清血
9、清1血清2血清3l I , 2 Q. 1 O. 2 O. 2 十十寸斗可卡+十+才|卜2 I , 1 。I( O. 2 O. 2 +十十十十斗斗+十十乙振O. 2 + .1 I -f t I , 8 O. 1 0.2 3 脑2墨I , I 6 O. I 抗。.2 后。24 原O. 2 置(). 2 5 1 : 32 O. I ) 在1 , 64 。.1 0.2 ( 。.2 振荡后6 冰箱过夜置-M 4 O. 1 O. 2 0.2 I , 2 ( 取o O. 1 正O. 2 出O. 2 水浴2 1 , -1 O. I 常对O. 2 后O. 2 3 I , 8 置u KA中A2)将血凝素原液作16
10、0倍稀释。4.2.2 在微量l血凝板的第1排(横)各孔的上边分别标i己被检血清号、自j件l虹清号、阳性血清号。第1行(纵)各孔的外侧边标记血清的稀释度。最后一排作红细胞对照。4.2.3 第2排到第7排各孔加入O.4%pH9. 0的棚酸缓冲液25L。第8排加50L，4.2.4 第1.2排按己标记的血清号每孔分别加相应的血清2511.L)4.2.5 j功稀释器，先经生理盐水预J钮，并排净液体，插入第2排各孔，充分混合后.蘸取25L到第3排，依次倍比稀释至第7排，最后从第7排各孔中蘸取25L弃去，第8排作红细胞对照。4.2.6 除第8排外，各孔分别加入8个单位的血凝素25L，在微量振荡器振荡3mm，
11、置室温(2(_)C-2SC)30mino 4.2.7 各fL分别圳人0.33%鹅红细胞悬液25L，摇匀后宣37恒温箱30min，取出判定结果。4.3 结果如lIif判定时光看对照。当被检血清对照、阴性血i青对照和红细胞对照均完全小凝集，血凝素对照除1单位乱世十卡或斗凝集，而J8单位孔、4单位孔、2单位孔均完全凝集时间l口I由前向后淫孔检查被枪血泊的抑制效价2以能完全抑制红细胞凝集的被检血清的最高稀释倍数作为该血清的血凝抑制J抗体效价，139 GB/T 18638 2002 表2C举例血清的血凝抑制抗体效价为1, 160。患畜恢复期血清的血凝抑制抗体效价比急性期的血清白4倍以r.，或单份血清作免
12、疫球蛋白MClgMl处理后，处用后血清的抗体效价比处理前的降低2个滴度以上时.均口j诊断为流行性乙型脑炎病畜。马强流行性乙型脑炎感染的血凝抑制抗体最低滴度暂定为1 40。表2微量血凝抑制试验(举例), I 血清稀梓度10 20 10 80 160 320 640 民细胞对照Q. 1 %pH9, 0棚酸缓冲液10倍稀草草血清25 25 25 25 25 25 25 50 8单位血凝章25 25 25 25 25 25 25 振荡3min后，置室温30min (J.33%鹅红25 25 25 25 25 25 25 25 细胞(pH6.1?摇匀后置37C恒温箱30min 判定结果一十+l+ l 1
13、 t () A1 钙镶溶液(用于补体结合试验)氯化续(MgCl，. 6H2() GB/T 18638-2002 附录A(标准的附录)试剂的配制10.0 g 氯化钙(CaCl，. 2H2() 4.0 g 加蒸馆水至100mLo 105 kPa 20 min高压灭菌。A2 0.4%牛血清白蛋白pH9.0砸自量缓冲液(BABS)(用于血凝抑制试验)母液J, 0.05 mol/L棚砂溶液蹦砂(Na2H，O， 12HJ) 双蒸馆水或无离子水加至母液I, 0.2 mol/L珊酸溶液唰酸(H，130，) 加双蒸馆水或无离子水至5.2 g 250 mL . 2 g 100 mL 使用液2母液J32 mL+母液
14、18mL十生理盐水460mLo配好后测定pH.如不到U9. O.可加适量。.05mol/L棚砂溶液。105kPa 20 min高压灭菌。临用前，在使用液中添加0.4%牛血清白蛋白。A3 阿氏液(用于血凝抑制试验和补体结合试验)葡萄糖拧橡酸饷2.05 g 0.8 g 氯化纳(NaCl)0.12 g 加双蒸馆水或无离子水至100mL.56 kPa 20 min高压灭菌。A4 生理盐水(用于补体结合试验和血凝抑制试验)氯化纳(NaC)8. 5 g 加双蒸烟水或元离子水至1000 mL. l 05 kPa 20 min高压灭菌。A5 25%自陶土悬液(用于血凝抑制试验)取优质白陶士粉末25日，加pH7
15、.4磷酸盐缓冲液至100mL.I05 kPa 20 min高压灭菌。4(、保存，可Jf1个月。临用前播匀。A6 不同pH值硫酸盐缓冲液(PBS)母液, 1/15 mol/L磷酸氢二锅溶液配制无水磷酸氧二纳9.47 g 加双蒸馆水或无离子水至1000 mL 母液I,1 /15 mol/L磷酸三氢饵溶液配制磷酸二氧惆9.08 g 加双蒸饱水或无离子水至1000 mL pH5.8 PBS，母液18.0 mL十母液192mL十生理盐水566mL; J 4 J G8/T 18638 _ 2002 pH6.0 PBS，母液112.2mL十fj.液H87.8mL十生理盐水566rnL; pH币.2PBS母液
16、118. 6 mL十岛被H81.j mL十生理盐水566mL; IH6. 1 PBS，母液126. 7 mL牛rJ:i也TI7:. 3 mL十生理盐水566mL; 川i6.6PBS母液137.0 IllL+母液H62.5 mL十ffk理盐水566mL; pH7.4IBS，时液I80. 8 mL十峙液I19守2mL十生理盐水566mLo 校jLpH 自后.105kPa 20 min高压灭菌。附录B(标准的附录)补体结合试验的预备试验81 溶血素效价商定81. 1 溶血素的稀释吸取溶血紊O.1 mL (含50%甘油者用。.2mL).加l钙侯盐水9.9 mL (含5(l)甘汕者1m9.8 mL).混
17、匀后即为1, 100的溶血素，然后取1 100溶血素1mL加钙筷盐水4mL.即为1 500的溶血素.再按表Bl进行稀择。表Bl溶血素的稀释钙馁蓝水1 : 500 试管号溶血章稀释倍数1-一)一一_-一一-L 1 O. 1 。11 : 1 000 于O. 3 O. 1 1 2 000 3 0. ,) o. 1 1300() 。7。11 : .) 000 5 Q. 9 。1! : :i 000 G 1. 1 。11 : f 000 J 1.3 。j1 : 7 000 8 1. 5 O. 1 j , 8 000 9 1. 7 Q. 1 1 9 000 10 1. 9 O. 1 1 10 000 81
18、- 2 洛血素的滴定取一支1mL吸管dli高稀释度开始，将各管己稀释的溶血素吸到另一排小试管内，每管。1mL，然后按表132依次加入补体、钙镣盐水及1%绵羊红细胞，摇匀后，置:17C水浴中30 min，观察结果。J运B2溶JrL素的滴定溶血章补体(1 50) 钙续盐串1%绵羊红细胞悬液出管号结果最rnL mL mL 稀释度mL -一一一一1 , 1 000 O. 1 O. 2 o. 2 O. 1 全溶2 1 , 2 000 。1O. 2 o. 2 O. 1 报i匀后全t在3 13000 。1o. 2 0.2 O. 1 置:lH全榕4 !:,IOOO 。1O. 2 口.2。1在恪中m 竹5 1
19、: :i QO (l 。10. 2 O. 2 O. 1 30 min I事6 1 ; G 000 。1O. 2 o. 2 O. 1 全f轩J 1 : 000 。10.2 o. 2 O. 1 人部分溶解8 1 , R 000 。1o. 2 o. 2 。1做;有9 1 : 9 000 。1O. 2 o. 2 o. 1 斗、济10 1: 0000 (L 1 o. 2 0.2 (). 1 不前112 GB/T 18638-2002 81.3 溶血浆单位计算2能使红细胞完全溶解的溶血素的最高稀释度.称为i个溶血素单位。表2中判定结果为第6管，郎。.1mL ! 6 000的浴血素含有1个单fL试验中应用2
20、个单位的溶血素.即将溶血索稀释成1, : 000.则O.!mL中含有2个单位苦奋血素。112 补体效价1商定82.1 滴定方法2吸取补体O.lmL，:fJp钙谈盐水4.9mL.即1: 50稀粹补体，然后按表旧的量，分别加入二二娇小试缝中，再依次加入鸽读盐水、4个单佼浴血素或1 5导曾释主运凉，;再匀后，放37C水浴l30 min.再加人致敏绵羊红细胞1%绵羊红细胞;除液与等锺2个单位海血索中目混合，放37C水浴415 min)，摇匀后，放37C: 7(浴中30min，观察结果。82.2 补丰单位的计算:能使红细胞完全溶解的最小补体量为一个单位，正式试验和f草原漓定时都1112个单位的补体。如表
21、B3所示.0.12mL的1 50补体为个单位.2个单位补体应为。自24mL的1, 50 补体.山子正式试验和抗原漓定t每管应刻的补体革是为告.2mL，故需按式(l)换算其稀释2变z(50XO.2) x=一一一-zz4l. . (B!) O. 24 将来草草释手H本稀将成1: 41.那可使0.2mL内含2个单位的补体。具体方法是在1mL补体内却40 mL钙续盐水，即为l41稀稀。表且3补中效价的满定稀桦抗原钙镶盐7)(致敏红细胞结果举例mL mL mL 病毒抗原. 0:) O. 1 O. 25 O. 2 q辑2 。自8Q. 1 0.22 。2辙溶3 。10O. 1 0.20 0.2 傲不溶4 (
22、)晶12。1O. 18 O. 2 全榕 O. 14 Q. J O. 16 0.2 全楼白O. 16 O. 1 O. 14 0.2 全碍事正常脑组织对照抗原吗0.05 。每1台.2S 放窒0.2 i鼓置不费苦8 0.08 Q. 1 o. 22 37 ( O. 2 37 ( 激熔9 O. 1 。Jo. 20 7)(泊中O. 2 7li暗中微不溶10 0.12 O. 1 。但1830 min 0.2 30 min 全溶1 1 。H。自lO. 16 0.2 生溶12 Q. 16 o. 1 O. 14 O. 2 溶盐水对黑13 o. 0:) 。35O. 2 不溶14 0.08 0.32 O. 2 敬溶1
23、5 Q. 10 Q.30 0.2 散不溶16 。120.2阜O. 2 金榜17 。140_ 26 0.2 全溶18 。160.24 0.2 全溶113 G8/T 18638-2002 的病毒抗原效价的滴定抗原滴定A般按方阵法进行，即用倍比稀释的己知附件血清与倍比稀释的抗原进行试验。按表H4进行抗原和血清稀释嘈表中举例说明效价滴定结果。8 3- 1 滴定方法按表4纵横排列试管，分别加入稀释的抗原和免疫血清各0.1mL每管加入稀释补体0.2mL(含2个单位)。表84抗原效价滴定(举例)免疫血清正常血清(1, 4) 病毒抗原病毒抗原抗补体对照抗补体对照1 , 2 1 4 1 8 1 , 16 1 3
24、2 1 , 64 1 128 1 2 1. 1十十十十一-+十+十卡十十十十斗十+1 4 十+斗斗十十十十十十十十十十+十+十十1 8 1 1 1十斗+十)l 卜1 一十+十1卜十斗+1 16 十十十十斗+十十+ 卡十+十1 32 t -卡十十I1 .1 卡十斗斗+ 斗1 : f-I 十十+十卡十十十十+ 十1 12日IF今常抗原(1 。抗补体对免疫血清抗补体对照B3. 2 对照管设置B3. 2. 1 免疫血清抗补体对照:将免疫血清稀释为1 2、1, 4、1, 8.每管0.1mL.每个稀释度再加入钙馁盐水0.1mL、稀释补体O.2 mL.但不加抗原。B3. 2. 2 病毒抗原抗补体对照:将病毒
25、抗原稀帮为1 2、1, 4、1, 8.每管各加O.1 mL.再加钙续盐水O. 1 mL.稀释补体。.2mL , B3. 2. 3 正常血清抗补体对照:在7管1 4正常血清0.1mL中，分别加入不同稀释度的病毒抗原O. 1 mL.稀释补体0.2mL。时.2. 4 正常抗原抗补体对照:在7管1 4正常抗原0.1mL中，分别加入不同稀释度的免疫血清。1mL，稀释补体。.2mL。83.2.5 溶血素对照:加钙续盐水0.4mL于1支小试管中。83.3 感作将各管擂匀，置4C冰箱内过夜，次日取出，放于37C水浴中30min，每管加人致敏绵羊红细胞悬液0.2 mL，置37(水浴内30min，判定结果。B3. 4 结果判定完全抑制溶血者为十十十十，75%抑制溶血者为斗+ .50%抑制溶血者为十十，25%抑制溶血者为.+ ，完全不抑制溶血者为。与最高稀释度免疫血清发生100%或75%抑制溶血的抗原.其抗原的最高稀释倍数就是抗原的效价。表84举例为1 32。正式试验时须用较高浓度(约48倍)的抗原，一般用抗原原液的1 4或1, 8稀辑液。I 1 I
