1、GB/T 18639-2002 前主主缸二狂犬病Crabies)是由弹状病毒科狂犬病病毒引起的一种人兽共患的急性接触性传染病。主要侵害中枢神经系统，引起狂暴不安和意识紊乱等症状，最后麻痹、衰竭而死。发病率不高，病死率几乎为百分之百。本病呈世界性分布，以亚洲最多发生。我国也不例外，近年来有增多的趋势。世界各国t分重视狂犬病的研究和检疫。世界动物卫生组织WorldOrganization for Animal Health (英儿OfficeInten tonal des Epizootic(法)，OIEJ和我国已将其列为重点防制的工类动物疾病。狂犬病症状非常明显，却非十分特异，且无肉眼可见的特殊
2、病变。狂犬病的确诊有赖于实验室的检查结果。但是，由于本病发病急，病程短，病死率高，使得实验室诊断通常以检查病毒抗原为主。例如，世界卫生组织(WHO)已把基于病原鉴定的内基氏个体(negribodies)检查、免疫荧光试验和小鼠及细胞培养物感染试验，作为诊断狂犬病的定件方法并将其标准化。OJE予以采纳并向各成员国推荐使用。本标准是参照WHO和OJE推荐的这些方法，结合我国的研究成果和实际情况而制定的。本标准的实施，对提高狂犬病的诊断和检疫水平，及时采取防制措施，保证人畜健康，将起到重要作用。需要指出的是，内基氏小体检查和免疫荧光试验分别可能产生5%-10%和2%-5%的假阴性结果。因此，在进行上
3、述两项检查的同时，应进行小鼠感染试验，即把这三项检查视为狂犬病诊断的=个必要程序。本标准的附录A为标准的附录，附录B为提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国人民解放军农牧大学。本标准主要起草人:宣华、向华。J 4 ,1 中华人民共和国国家标准狂犬病诊断技术GB/T 18639 2002 Diagnostic techniques for rabies in animals 1 范围本标准规定f狂犬病内基氏小体(negribodies)检查、免疫荧光试验、小鼠和细胞培养物感染试验的技术要求。丰标准适用于各种易感动物的狂犬病的诊
4、断和检疫。2 内基氏小体检查2. 1 准备2. 1. 1 器材:胶皮子套、口罩、防护眼镜等个人防护器具;骨锯、骨凿、骨剪、脑刀等动物解f!lJ器具;切片机、染鱼缸等组织制片与染鱼器具;光学显微镜等。2. 1. 2 标本保存液，10%(体积分数)福尔马林溶液.50%(体积分数甘油生理盐水。2. 1.3 染色液赛勒(Seller)氏染色液，曼(Mann)氏染色液，其配制方法见附录A(标准的附录人2. 1.4 人身防护:见附录B(提凉的附录)。2. 2 样品的采集和运送2. 2. 1 对口I疑为狂犬病而扑杀或死亡的动物(含实验感染小鼠).应在死亡后3h内(越早越好)由大脑海马网(mmon氏角)、小脑
5、皮质和延髓各切取1cm3组织数块，放入灭菌玻璃瓶，再置于冰瓶内于24h 内送达实验室。2.2.2 不能、立即送检者，应加10%福尔马林溶液固定，或加50%甘泊生理盐水.4C保存送检。2.2.3 不能就地取脑时，小动物可送检完整的新鲜尸体，大动物可送检未剖开的头颅。2.3 标本片的制备2. 3. 1 对新鲜脑组织，可用外科刀切j开，以通过火焰去脂的载玻片在其切面上触压一下制成压印片。每张载玻片可接触23个部位，每份材料做34张。2.3.2 在甘油盐水巾保存的新鲜病料，应先用生理盐水彻底洗去甘油，方可制片，制片方法向2.3. 1 0 2. 3. 3 所有历印片于室温下干燥后，浸入甲醇溶液固定2mi
6、n 0 2. 3. 4 经10%福尔马林溶液充分固定过的脑组织可按常规方法制备组织学切片。2. 4 染色2. 4. 1 赛勒氏染色法在经过甲醇同定并风干的!王印片上，滴加赛勒氏染色液(以盖满!li印丽而不溢为度)着染5S 10 S，然后用蒸馈水冲洗，干燥后镜检。2.4.2 曼氏染色法2.4.2.1 将经过甲醇固定并风干的原印片，或者经过脱蜡、浸水、风干的切片浸入曼氏染色液中浸染。压印片浸染5min.切片浸染时间因温度而异(室温下24h.或38C温箱中12h.或60C温箱中2仙。2.4.2.2 以蒸锵水快速洗去染色液，至元浮色出现为止，用吸水纸吸干。2.4.2.3 以无水乙醇稍洗，至标本区刚出现
7、蓝色为度。中华人民共和国国家质量监督检验检疲总局2002- 02 -19批准2002 - 05 -01实施116 GB/T 18639-2002 2.4.2.4 没人碱j乙醇分化1;1民，._20s，至标本x千山现红色。2.4.2.5 依次通过龙水乙醇和蒸饱水各数秒钟，分别洗去氢氧化TJJ和乙醇.再漫入微酸性水中1mm 2 mino 主化期间，经常于显微镜下观察，至细胞核出现蓝色为宣;如果核蓝色过深，说明酸化过度，nf 退时至碱性乙醇，再作短时分化。2.4.2.6 以蒸熠水水洗后，依次通过95%乙醇和无水乙醇脱水，并经二甲苯透明噜最后加l香胶封固。2. 5 显微镜检查及判定内基氏小体嗜酸性，位
8、于神经细胞胞浆巾，呈圆形、椭圆形或棱形，直径3ILm20!1l，一个细胞内通常含4气年个内基氏小体.但也可含在几个。用赛勒氏染色时.内基氏小体呈桃红色，神经细胞为蓝紫色，组织细胞为深蓝色。用曼氏染色时，内基氏小体为鲜红色.神经细胞的胞核为蓝色、胞浆为淡蓝色，红细胞为粉红色。有时，在鲜红色的内基氏小体中还可以见到嗜碱性的蓝色小颗粒。内幕i飞小体罚i狂犬病包涵体，为主i犬病所特有。因此，-8检出内基民小体，即可确诊。fl.tE检查犬脑时，I起注意与犬瘟热病毒引起的包涵体相区别。犬瘟热包涵体主要出现于呼吸道、膀脱、肾孟、胆囊、R管等器官粘膜l一皮细胞的胞浆和胞核肉。在脑组织内，见于原浆细胞和一些小胶
9、质细胞的核内，在冲经原内很少见到。3 免疫荧光试验3. 1 材料准备3. 1. 1 器材使光棍做镜，NM箱，载玻片(片序2mm以f)，盖玻片，冰冻切片悦。3. 1. 2 试开IJ3. 1.2. 1 异硫氨酸荧光黄(FITC)标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白(以下简称狂犬病荧光抗体)和未标记打L狂犬病病毒i村种球蛋白(以下简称狂犬病未标记抗体)，由制标单位提供。使用时，用。，02%伊文思蓝(Evans bue)染色液稀择成24个染色单位。例如，荧光抗体染色效价为1: 64，则作1:321:8稀释后使用。3.1.2.2 丙酬(分析纯)使用前置普通冰箱内预冷至4C左右。3.1.2.3 0.01 mol/L
10、 pH7. 4磷酸盐缓冲盐水CPBSS)。3. 1. 2. 4 0.02%伊文思117;染色液。3. 2 样品的采取和运送|司2.2。3. 3 标丰片的制备3. 3. 1 病料标本片制备3.3. 1.1 按照2.3的方法和安求制得压印片，也可由切面刮取施细胞泥均匀涂成直径约1cm的阴形涂抹面，或者参照常规方法将被检脑组织制成厚度在5m8m的冰冻切片。3. 3.1 .2 标本片于空气中自然干燥，在冷丙嗣中固定4h或过夜，然后在冷磷酸盐缓冲盐水中轻轻漂洗，取lii后燥，在标本区周围用记号笔划圈.立即染色检查，或密封于塑料袋中，置20C暂时保存。3. 3. 2 细胞培养物标本片制备接种F被枪病料的细
11、胞烧养物(如神经母细胞瘤细胞)，继续在二氧化碳恒温箱中培养48h，随后用橡皮刮子刮取细胞泥在载玻片上制成薄而均匀涂片。1可以盖玻片为载体生长的细胞培养物时，则11.1直接取此长满细胞单层的盖玻片作为标本片。然后按3.3. 1. 2风干、固定和保存。3. 4 染色3. 4. 1 月i吸管吸取稀释的狂犬病荧光抗体，滴加12滴于绞肉嗣I剖定的标本片上.使其布满整个标本|芷。3. 4. 2 将标本片置于搪瓷敬内(盘底垫以浸湿的纱布，纱布上放玻片架人放37C、恒温箱内看染IL G/T 186392002 30 min 0 3.4.3 取出玻片.用磷酸盐缓冲盐水轻轻冲去玻片多余的染色液，再将玻片连续通过3
12、缸(或杯)磷酸盐缓冲盐水，每缸浸泡3min，并不时轻轻振荡。最后在蒸馆水中浸泡3min。3. 4. 4 在吸水纸t轻轻磕尽玻片t的蒸馆水，自然干燥后，于标本区上滴加1滴甘油缓冲液(分析纯中性甘汹9份，pH7.4磷酸盐缓冲盐水11份儿覆盖玻片扣于载玻片上，然后镜检。3. 5 对照设置3. 5. 1 已知狂犬病病毒标本片加狂犬病荧光抗体染色应有特异荧光出现。3. 5. 2 已知狂犬病病毒标本加狂犬病未标记抗体阻抑后，再加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现。3. 5. 3 己句l狂犬病病毒阴性标本片加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现。3.6 荧光眼微镜检查及判定一般用蓝紫光，激发滤光片用BGl
13、2，吸收滤光片用。G，或G仇，以满足异硫佩酸荧光黄的荧光谱要求为准。暗视野聚光器比明视野聚光器易于观察特异性荧光。物镜浸油须用无荧光镜泊，也可以封片用的甘油缓冲液代替。先检查对照标本。只有在对照标本的染色结果符合3.5. 1 3. 5. 3要求时才能去检查被检标本。特异性荧光呈亮绿至黄绿色，背景细胞染成淡黄或橙红色，细胞核成暗红色。狂犬病特异性荧光颗粒较大，数量不等，位于细胞浆内。凡在神经细胞胞浆内发现特异性荧光，均应判为狂犬病病毒感染者u4 小鼠和细胞培养物感染试验4. 1 材料准备4. 1. 1 器材:细胞培养瓶(或管)，二氧化碳恒温箱，微量超滤器(滤膜孔径。.45m) ，微量组织研磨器，
14、普通离心机及离心管，0.25mL注射器及针头等。4. 1. 2 试剂。5%水解乳蛋白汉克氏(Hanks)液，伊格尔氏(Eagle)最低要素培养液EMEM)，楼牛血清，20000 IU /m!.青霉素溶液，20000吨/m!.链霉素溶液等。4. 1. 3 小鼠:无特定病原(SPF)易感小鼠，57日龄(也可用34周龄者，但发病时间可能稍推迟)。4. 1.4 仓鼠肾传代细胞。HK)或小鼠神经母细胞瘤(NAC1300)细胞。4.2 样品的采取和运送除可按照2.2的方法和要求送检新鲜脑组织外，还应采集唾液送检。方法是:用灭菌吸管吸取或用灭菌棉拭棒蘸取腮腺口附近的唾液，置人1mL2 mL内含2%灭活豚鼠血
15、清和抗生素的Hanks液中，低温保存备用。4.3 样品的处理脑组织用组织研磨器磨碎，加0.5%水解乳蛋白Hanks液制成20%(m/V)混悬液，以3000 r /min 离心30min，吸取t清液，加入青霉素500IU/mL和链霉素500g/mL.在4.C处理3h4h，即可用于感染小鼠和细胞培养物的接种样品。唾液样品亦需经上述离心和杀菌处理。怀疑有污染的样品，可用。45m微孔滤膜过滤法处理。4.4 感染方法4.4.1 小鼠感染法每份样品用小鼠46只。左手固定小鼠，在耳与眼之间用腆酒消毒。右手持吸取接种样品的。.25mL/t射器在消毒部位刺人硬脑膜下，每只小鼠注射0.03mL。对照小鼠2只，按同
16、法同剂量注射稀释液(即0.3%水解乳蛋白Hanks液)。每天早晚各观察1次，记录是否有发病小鼠。至少观察28d 0 4.4.2 细胞培养物感染法每份样品接种46管细胞培养物。取接近长成单层的细胞培养物用Hanks液轻洗3次，每管接种样品O.1 mLO. 2 mL，在3TC恒温箱内吸附1h，用Hanks液洗1次(亦可不洗)加入含有1%2%棋I I只GB/T 18639-2002 牛血清的EMEM液(添加量随细胞瓶大小而定).放二氧化碳恒温箱(37C)内继续培养。同时设细胞对照2管，以0.5%水解乳蛋白Hanks液替代样品上清液。每天观察I次，记录是否有致细胞病变作用(CPE)出现。至少观察15d
17、 , 4.5 感染性鉴定4.5.1 小鼠感染性鉴定若对照小鼠健活，而样品接种小鼠在接种后4d7 d开始发病，呈现瘟孪、麻痹等神经症状并死亡，可确诊为狂犬病感染者。如果症状不典型，可扑杀取脑，采用内基氏小体检查或免疫荧光试验鉴定之。如果7d后不发病，可将其中2只小鼠放血致死，取脑作成10%(m/V)混悬液，接种健鼠盲目传代;第2代在7d左右还不发病时，再盲传1代;至第3代经4周观察仍不发病时，可报告狂犬病小鼠感染试验阴性。对观察期间死亡的小鼠，应进行内基氏小体检查或免疫荧光检查以鉴别之。4.5.2 细胞培养物感染性鉴定若对照细胞培养物正常，而样品接种的细胞培养物不论是否I!P电细胞病变.但经免疫
18、荧光试验证实有特异性荧光时，可确诊为狂犬病感染者。为缩短检验时间，可在接种后创h抽取12管细胞培养物进行免疫荧光试验。对既无细胞病变又无特异性荧光反应者，应再有传2次。第3代经15d观察仍无细胞病变和特异性荧光时，可报告狂犬病细胞培养物感染试验阴性。l1 Y A1 塞勒(Seller)氏染色液t制l1美蓝饱和溶液碱性美蓝兀水甲醇(分析纯)i非被1复红饱和溶液碱性复主l元水甲醇(分析纯)l寻液m，尤水甲醇(分析纯)GB/T 18639- 2002 2.0 g 附录A(标准的附录)染色液的配制100.0 mL 40.0 g 100. 1) O1 L 使用液:取l过液J1 ml. 41吐液m25 m
19、L i昆合，再加入母液D2 mL4 mL，充分混合.装入褐色脱巾，寒紧瓶寒保存备用。此染色液111.制时间越久，染色效果越好。A2 曼(Mann)氏染色液I. 0 g!lOO ml币基监水溶液. 0 gllOO mL伊红水榕液1m !，馆水至3SmL 35mL 100 mL 0 国已制A.j.在甲基蓝水浴液和伊红水榕液分别过滤后.各取35mL，再IJIl蒸铺水补足100ml.。A3 碱性乙醇溶液取无水乙醇:lOO1L，hl川.Og/IOOO1I.氢氧化饷溶液5滴(约O.3 O1LO. 4 ml.)即成。A4 微酸性水溶液取蒸倒水3001L，加纯冰乙酸搭液45滴(约。.3mL)即成。附录B(提示
20、的附录)人身防护B1 从事狂犬病口I疑动物解剖和检疫检验的人员，J .穿戴作服、手套、1罩和防护眼镜，防止感染性病料或气溶胶进入粘膜和伤II 0工作期间不准吸炯、喝水、吃东西。工们结束时，要洗于洗脸和消毒。B2 被狂犬病叮疑功物咬伤者，应立即用大量20%肥皂水、O.1 %新I吉尔灭溶液或清水充分冲洗，fli Hl 7S%r阿赖或2%3%腆酒消毒，彻底清理伤门，注射狂犬病疫苗。必要时，应同时注射狂犬病免疫血泊(或精制免疫球蛋白人B3 尸体臼l检l一作1苗在病理解剖室内或其他安全地点进行。采完病料之后，应将尸体连同污物起焚毁或以培!.小得阳作它用。污染的场地、器械和工作服等应彻底消毒。B4 们活检的狂犬病可疑动物，在确诊为非狂犬病感染功物之前，应将之严格隔离，防止侵袭其他人畜。
