1、GB/T 18644- 2002 前言猪囊尾蝴病(cysticercosiscellulosae) (俗称猪囊虫病)，是由寄生在人体小肠内的猪带缭虫(taenia solium)的幼虫(cysticercuscellulosae)所引起的，是一种危害严重的人兽互源性寄生虫病。世界动物卫牛纫织WorldOrganization for Animal Health(英儿。fficeIntentional des Epizootic(法)，OIE将该病列为B类疾病。H前，该病还广泛存在于发展中国家，不仅严重地影响着养猪业的发展，造成巨大的经济损失，而且述威胁着人类身体健康，乃至生命。因此，1993年
2、联合国卫生组织将该病列为需要根除的六大疚病之气猪囊尾拗病多不表现临床症状。目前，该病的检疫方法有舌检查法和免疫学检查法。前者仅适用于舌寄牛(27%30%)的病猪。后者包括皮肉变态反应、炭粒凝集试验、间接红细胞凝集试验、补体结合反应、琼脂扩散试验、免疫电泳和酶联免疫吸附试验ELISA)等等。其中，ELlSA法具有高敏感性和特异性，是最常用的一种方法。丰标准从病原分离、鉴定和血清学(ELISA方法)两方面规定了猪囊尾蝴病检查方法，结果更为1 i件。本标准规定的ELISA法，适用于感染猪的定性，最早可以检出感染9天的囊尾蝴病猪。也适用于免疫猪群抗体水平的评估。本标准的附录A为标准的附录。中;标准由中
3、华人民共和国农业部提出。本标准由全闰动物检疫标准化技术委员会归口。卒标准起草单位:吉林农业大学。本标准主要起草人:韩字、姜秀云、赵权。173 中华人民共和国国家标准猪囊尾蝴病诊断技术G/T 18644 2002 Diagnostic techniques for cysticercosis cellulosae 1 范围本标准规定f猪囊尾哟病的病原分离与鉴定和酶联免疫吸附试验(ELISA)两种诊断技术。本标准适用于猪囊尾蝴病的诊断和流行病学调查以及检疫。2 病原分离与鉴定2. 1 病原分离2. 1. 1 样品采集采集猪的咬肌、舌肌、内腰肌、隔肌、肋间肌、肩脚肌等，亦可采集脑、心脏、肝脏、肺脏等
4、。2. 1. 2 样品分离成熟的猪囊尾拗为长椭圆形(6mm10 mm)X5 mmJ.半透明的囊壁内充满液体，上有一个茶粒大小的白色小结节即为头节(scolcx)和颈节(neck)。脑内寄生的则为圆球形向mm-10mm 将上述任何部位的囊尾蝴，以手术刀和慑子剥离后，以生理盐水洗净，并用滤纸吸干。2. 2 病原鉴定2. 2. 1 分离样品的压片制备以剪刀剪开囊壁，取出完整的头节，再以滤纸吸干囊液后，将其置于两张载玻片之间并压片，于两张载破片问加人)2滴生理盐水后置于显微镜下镜检。2.2.2 镜检以低倍(物镜8倍、目镜5倍)观察囊尾拗头节的完整性。2.2.3 结果判定低倍镜检，可见到头节的顶部有顶突
5、，顶突上有内外两圈排列整齐的小钩，顶突的稍下方有Vll个均等的圆撮状吸盘，即判为猪囊尾蝴。3 酶联免疫吸附试验(ELISA)3. 1 材料准备3. 1. 1 器材ELISA反应板、酶联免疫检测l仪、加样器、洗瓶、10cmXl cm普通滤纸条等。3. 1. 2 试剂猪囊尾拗层析抗原、葡萄球菌A蛋白(SPA)辣根过氧化物酶HRP)标记物(HRP-SPA)、猪囊屈哟标准阴性和阳性全血滤纸片等。3. 1. 3 被检猪余血血片将10cmX 1 cm普通滤纸条的一端标记被检猪号码，另一端吸取被检猪任何部位血液)，-2滴.F室内阴干后，置于4C冰箱内(可保存6个月)。3. 1. 4 溶液配制中华人民共和国国
6、家质量监督检验检疫总局2002- 02 -19批准2002一05-01实施17 1) GB/T 18644 -2002 浴液自己制的厅法见附法A(标准的附录)0 3. 2 操作方法3. 2. 1 抗原包被3.2.1.1 元以抗原包被液(见附录A中A1)洗涤ELlSA反应板各孔二次。3.2.1.2 以抗原包被液将抗原按使用说明书稀释至工作浓度。3.2.1.3 IIllm样器110作浓度抗原至ELlSA反应板各孔内，每孔0.1mL.加盖后置于室温(1(，29 l )过夜。it但被11做的ELl5A反应板加盖后置于冰箱冷冻室内口I保存6个月。或将包被过夜的ELISA反应板按3.2.2hi.去洗古最后
7、.晾干，装入塑料袋内密封.置于4(冰箱内(叮保再l个月)。3. 2. 2 洗涤月jtJ甩净包被过夜的ELlSA反应板孔内的抗原包被液，每孔加入洗涤液(见附录A中A2l，浸泡) m i Il后用力甩去洗涤液.并用滤纸吸去残留的洗涤液和驱除孔内气泡，重新加入洗涤液，按同样方法jUt涤1次，ejJ:l X 3 min冲洗。3. 2. 3 I阻片的处理将被怡的1片、标准阴性血片及标准阳性血片均剪成1cm X 1 cm大小，分别置于青霉素瓶内，每1 cm只I(0) 缸片加入稀释液(见附录A中A2l0.3mL.浸泡20min，即血片变白后即可。3. 2. 4 1m样3. 2.4. 1 4母份被枪血片浸液加
8、两孔，每孔。.1mLo 3. 2.4.2 标准阴性、标准阳性对照孔加相应血片浸液两孔，每孔0.1mL。.2.4.3 常Ll对照孔加稀释液两孔，每孔0.1mL 3. 2.4.4 hll样后加l盖，于宰温(l1C29(，l放置30min 0 3. ? 5 洗涤)ilJ;同:l.2.2o3. 2. 6 川l酶标i己SI八3. 2. 6. 1 HRI-SPA标准物按使用说明书以稀释液稀释至工作浓度。3.2.6.2 被检.fL、标准阴性孔和标准阳性孔每孔加HRP-SPA标记物0.1mL J i 6.3 专内对照于LVl、加。.1mLo 3.2.6.4 加完后110盖，于室温(llC29C)放置30mn
9、0 3. 2. 7 洗涤方法再13.2.203.2.8 加底物4号L!J11F，1配制的底物榕液(见附录A中A3)0.1mL，于室温(1C29Cl放置10min。3. 2. 9 终Jr_反应何.fLhll终止液(见附录A中A4)2滴，以终止反应。3-3 判定。对照fL成t的前提f，即在标准阳性孔呈深黄色，标准阴性孔呈无色或浅黄色，笔白孔呈元色，判定检测结果。3. 3. 1 t3拥IJ判定与标准阴性孔相比，颜色深于标准阴性孔者，即判定为ELlSA法阳性病猪(十l, 3. 3. 2 酶联免疫检测仪判定(490nm) 以写写们对照孔调零.测定被检孔透光(ODl值。当ODO.22，判定为ELlSA法阴
10、性(-);当()D11.26，妻IJJ.i二为ELlSA法阳性(十);当O.23二()DO.25，判定为ELISA法疑似(土).疑似者复检一次，仍为疑似则判为阳性。1 7:i GB/T 18644- 2002 A1 抗原包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.6)B.碳酸纳(Na，CO，)蒸馆水C碳酸氯铀(NaHCO，)族f自水3.18 g 300 mL 5.86 g 700 mL 附录A(标准的附录溶液配制日、C两液混合目J为抗原包被液，测pH(现用现配)0 A2 稀释液(吐温确酸盐缓冲液，pH7.4)B，磷酸氢二销(Na2HPO. 12H20) 14.5 g 蒸f自水202.5 mL C:磷酸二氢销
11、(NaH，PO， 2H20) 0.14 g 蒸惰水47.5 mL f B、C两液混合后，加氯化纳(NaClll9g和少许蒸馆水，溶解后加蒸馆水至2500mL，然后再加入吐温20Tw凹n-20).25 mL，即为稀释液，拥UpH(现用现配)。i友试剂既是被枪猪抗体的稀释液，又是洗涤液。A3 底物溶液(磷酸盐-拧楝酸缓冲液，pH5.0)Bz拧蒙酸(无水10_ 96 g 蒸馆水50 mL C.磷酸氢二纳(Na2HPO. 12H,o) 3.50 g 蒸馆水50 mL 取B液24.3mL、C液25.7mL和蒸惰水50mL，混合后加邻苯三胶O.04 g，避光溶解后，加30%过氧化氢(H，O，)O.45 mL.混匀后立即使用。A4 终止液2mol/L硫酸(H2S0，)i条简水浓硫酸(96%98%)混匀即可。176 177.8mL 22.2 mL
