1、GB/T 18646-2002 前当一口布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌属细菌致人畜共患的传染病变态反应性疾病，世界范围性威胁人类健康和影响畜牧业发展。动物布病主要自羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌感染羊、牛和猪等动物呈急性或慢性经过。另外，是人布病的主要传染来源。其临床主要特征是母畜流产、乳腺炎、不育和各种组织如辜丸、关节)的炎症。世界动物卫生组织WorldOrganization for Animal Health (英).Office Intentional des Epizootic (法).OIE将布病列为B类重要传染病，中华人民共和国传染病防治法将布病列为乙类传染病。为确
2、诊动物布病要尽可能分离病原体，并鉴定某种和生物型，但方法复杂，需要的时间长，而且阳性检出率低。因此布病最常用的检疫技术是血清学诊断。目前残国常用的血清学方法有虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验以及乳牛全乳环状试验。本标准的编制参考了。IE的诊断试验和疫苗标准手册有关章节，澳大利亚动物疾病诊断技术标准有关布病诊断部分和联合国粮食与农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合布鲁氏菌病专家委员会推荐的布鲁氏菌病实验室技术)(第三版)。本标准适用于对动物布病的检疫及监测。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D是标准的附录，附录E、附录F是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标
3、准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位z中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人:自文彬。188 中华人民共和国国家标准动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T 18646一2002Diagnostic tecbniques for animal brucellosis 1 范围本标准规定了动物布鲁氏菌病的诊断技术。本标准规定的虎红平板凝集试验、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验g试管凝集试验和补体结合试验适用于诊断羊种、牛种、和猪种布病感染的家畜。本标准规定的试管凝集试验不适用于犬种和绵羊副率种布病感染家畜的检疫。2 虎红平板
4、报集试验2. 1 材料准备2. 1. 1 抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。2.1.2 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。2.1.3 洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格。2.1.4 吸管或分装器，适于滴加0.03mLo2.1.5 牙签或火柴轩，供搅拌用。2.2 操作方法2.2.1 将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清0.03mL。2.2.2 在受检血清旁滴加抗原0.03mLo 2.2.3 用牙签类小捧搅动血清和抗原使之混合e2.2.4 每次试验应设阴、阳性血清对照。2.3 判定2. 3- 1 在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进
5、行判定。2.3.2 受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，元凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(一)。3 乳牛布病金乳环状试验3- 1 材料准备3- 1. 1 布病全乳环状抗原由制标单位提供，按说明书使用。3- 1. 2 乳样3- 1.2.1 受检乳样须为新鲜的全军L。3- 1.2.2 采乳样时应将母畜的乳房用温水洗净、擦干，然后将乳液挤入洁净的器皿中。中华人民共和国国家质量监督挫验检庭总局2002-02俨19批准2002 -05 -01实施1B9 GB/T 18646-2002 3. 1.2.3 采集的事L样夏季时应于当日内控杏，保存于2.C时，7d内仍可使用。3. 2 操
6、作方法3.2.1 取乳样1mL，加于灭菌凝集试验管内。3. 2. 2 取充分振荡混合均匀的全乳环状抗原I滴(约50L)加人乳样中充分混匀。3. 2. 3 置37C38C水浴中60mino 3.2.4 加温后取出试管勿使振荡，立即进行判定。3. 3 判定标准分为2a)强阳性反应(十+十)，乳柱上层乳I?形成明显红色的环带，乳柱臼色，临界分明sb)阳性反应(+)，乳脂层的环带呈红色，但不显著，乳柱略带颜色gc)弱阳性反应(+ ) ，乳脂层的环带颜色较浅，但比乳柱颜色略深;d)疑似反应(士)，L脂层的环带颜色不明显，与李L柱分界不清，乳柱不褪色se)阴性反应(一)，乳柱上层无任何变化，乳柱颜色均匀。
7、4 动物布病试管凝集试验4. 1 材料准备4. 1. 1 稀释液。.5%石炭酸生理盐水。检验羊血清时用含0.5%石炭酸的10%盐榕液，如果血清稀释用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，抗原的稀释亦用含0.5%石炭酸的10%盐溶液。4. 1. 2 抗原、阳性血清和阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。4. 1. 3 凝集试验管(三分管)、试管架、吸管及温箱。4.2 操作方法4.2.1 按常规方法采血分离血清。4.2.2 运送和保存血清样品时防止冻结和受热，以免影响凝集价。若3d内不能送到实验室，按每9mL血清加1mL5%石炭酸生理盐水徐徐加入防腐，也可用冷藏方法运送血清。4.2.3 受检血清的稀释以
8、羊和猪为例，每份血清用4支凝集试管。4.2. 3. 1 第管标记检验编码后加1.15 mL稀释液。4.2.3.2 第24管各加入0.5mL稀释液。4.2. 3. 3 然后用1mL吸管取被检血清0.1mL;加入第1管内，并混合均匀。混合方法是将该试管中的混合液吸入吸管内，再沿试管壁吹入试管中，如此吸入、吹出34次，充分混匀后以该吸管吸混合液0.25 mL弃去。4.2. 3. 4 取0.5mL混合液加入第2管，用该吸管如前述方法混合。4.2. 3. 5 再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去j昆匀液。.5mL. 4.2. 3. 6 稀释完毕，从第1至第4管的血清稀释
9、度分别为1, 12. 5、1, 25、1 50和1: 100。4. 2. 3. 7 牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本致，差异是第一管加1.2 mL稀释液和0.05mL被检血清。4.2. 3. 8 将0.5mL20倍稀释的抗原加入己稀释好的各血清管中，并振摇均匀，羊和猪的血清稀释则依次变为1: 25、1: 50、1: 100和1 200，牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为1 50、1 100、1 200和1 400 大规模检疫时也可只用2个稀释度，HP牛、马、鹿、骆驼用1 50和1 100，猪、山、羊、绵羊和狗用1 25和1 50 0 4.2.3.9 置3TC40C温箱24h，取出检查并记录
10、结果。190 GB!T 18646-2002 4.2. 3. 10 每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，即a)阴性血清对照z阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。b)阳性血清对照:阴性血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与受检血清同。c)抗原对照，1 20稀释抗原液0.5mL.再加0.5mL稀释液，观察抗原是否有自凝现象。4. 3 判定4. 3. 1 供判定参照比浊管制备方法见附录EC提示的附录)。4. 3. 2 结果判定4. 3. 2.1 凝集反应程度分为参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读a) +菌体完全凝集.100%下沉，上层液体100%清亮$b) +十菌体几于完全凝集，七层
11、液体75%清亮，c) +菌体凝集显著，液体50%清亮;d)十凝集物有沉淀，液体25%清亮;e)一凝集物无沉淀，液体均匀混浊。4. 3. 2.2 牛、马、鹿和骆驼1 100血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗1; 50血清稀释，出现十十以上凝集现象时，受检血清判定为阳性。4.3.2.3 牛、马、鹿、骆驼1 50血清稀释，猪、山羊、绵羊、狗1, 25血清稀释，出现+十以上凝集现象时，受枪血清判定为可疑反应。可疑反应家畜经3周4周后重检，如果仍为可疑，该牛、羊判为阳性。猪和马经重检仍保持可疑水平，而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现，该畜被判为阴性。猪血清偶有非特异性反应，须结合流行病学调查判定，必要
12、时应配合补体结合试验和鉴别诊断，排除耶森民菌交叉凝集反应。5 动物布病补体结合试验5. 1 材料准备5. 1. 1 稀释液，0.85 %生理盐水按常规方法配制。5. 1. 2 绵羊红细胞悬液采取成年公绵羊血，按常规方法脱纤、洗涤、离心，用稀释液洗涤34次，最后次以2000 r /min离心沉淀10min，取下沉的红细胞泥，以稀释液配制成2.5%红细胞悬液。5. 1. 3 抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素由制标单位提供，按说明书使用。5. 1.4 受检血清z收集和处理见附录A(标准的附录)。5. 1. 5 溶血素效价测定见附录B(标准的附录)。5.1.6 补体:采集及其效价测定方法见附录C(
13、标准的附录)。5.1.7 抗原z效价测定见附录O(标准的附录)。5.2 操作方法5. 2. 1 将1 10稀释经灭能(见附录A)的受检血清加入2支三分管内，每管0.5mL 5.2.2 其中一管加工作量抗原0.5mL，另一管加稀释液。.5mLo 5. 2-3 t述2管均加工作量补体，每管0.5mL.振荡混匀。5.2.4 置37C38C水浴20min，取出放于室温(22C25C)。5.2.5 每管各加2单位的溶血素。.5mL和2.5%红细胞悬液O.5 mLo充分振荡混匀。5.2.6 再置3TC38C水浴20min，之后取出立即进行第一次判定。5.2.7 每次试验需设阳性血清、阴性血清、抗原、溶血素
14、和补体对照。主试验各要素添加量和顺序如表10191 GB/T 18646-2002 表1布鲁氏菌病补体结合试验的主试验mL 对照管血清被检血清阳性血清阴性血清抗原溶血章补体血清加入量0.5 O. 5 O. 5 O. 5 0.5 O. 5 。稀释液。O. 5 。O. 5 。O. 5 。1. 5 1. 5 抗原O. 5 。0.5 。O. 5 。1. 0 。I作最补体O. 5 o. 5 o. 5 O. 5 0.5 O. 5 O. 5 。O. 5 37C3SC水浴20min 二单位溶血章D. 5 O. 5 O. 5 O. 5 0.5 O. 5 O. 5 O. 5 。2.5%红细胞O. 5 O. 5 0
15、.5 O. 5 0.5 。.5 O. 5 O. 5 O. 5 37C:-3SC在浴20min 判定结果举例十+十+十+十十+十十+5. 3 判定5. 3. 1 第一次判定，要求不加抗原的阳性血清对照管，不加或加抗原的阴性血清对照管，抗原对照管呈完全溶血反应。5. 3- 2 初判后静置lZh作第二次判定，第二次判定时要求溶血素对照管，补体对照管呈完全抑制溶血。5. 3. 3 对照正确无误即可对受检血清进行判定，受检血清加抗原管的判定参照标准比色管记录结果。标准比色管的制备方法见附录F(提示的附录。5. 3. 4 判定标准.。40%溶血判为阳性反应;50%90%溶血判为可疑反应;100%溶血判为阴
16、性反应。牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。192 GB/T 18646-2002 附录A(标准的附录受枪血清的采集和处理以常规方法采血和分离血清。用稀释液(5.1. 1)将血清作1: 10稀释，按表B1规定的水浴灭能。血清类别L一一羊马驴、骤黄牛、水牛、猪鹿、骆驼B1 稀释溶血素表A1各种被检动物血清的灭能温度和时间灭能温度IC5859 5859 6364 5657 54 附录B(标准的附录)溶血萦效价测定灭能时间/min30 30 30 30 30 取O.2 时，含等量甘汹防腐的溶血素，加9.8mL稀释液配成1: 100的基础稀释液，按表B1方法作进一步稀释。表B1溶血素稀释法管号1 2
17、 3 4 5 6 1 I 100稀释溶血章o. 2 O. 1 O. 1 O. 1 o. 1 O. 1 稀释液0.8 0.9 1. 4 1. 9 2. 4 2. 9 如血章稀释倍数500 1 000 1 500 2000 2500 3000 B2 按表B2加入各成分，而后3TC38C水浴20mn. B3 溶血景效价mL 7 8 9 10 11 O. 1 O. 1 O. 1 O. 1 O. 1 3.4 3.9 4. 4 4.9 5. 4 3500 4000 4 500 5000 5 500 从水浴中取出，立即判定结果，用1: 20补体0.5mL.在3TC38C水浴20min，能使2.5%红细胞液0
18、.5mL完全溶血的最小量溶血素为溶血素效价或称一单位榕血素。以表B2为例，对照管均不溶血.16管完全溶血，测定溶血素效价为3000倍.黯血章在主试验时溶血素的工作效价为滴定效价的倍量或称二单位溶血素，则工作效价为1500倍稀释。效价测定后.23个月内可按此效价使用，不必重测。表B2溶血素效价测定表mL 对照管管号2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 溶血章补体稀释班|稀释倍数500 1000150020002500300035004000450050005500 100 加入量O. 5 0.5 O. 5 O. 5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 O. 5 0.5 O. 5 。稀释
19、液1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 5 1. 5 2. 0 193 GB/T 18646-2002 表B2(完)mL 对照管管号2 3 4 5 6 7 B 9 10 11 潜血章补体稀辑檀1 20补体O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 。O. 5 。2.5%虹细胞O. 5 O. 5 0, 5 O. 5 O. 5 O. 5 0.5 O. 5 。，5 O. 5 O. 5 O. 5 0, 5 O. 5 37 C38C水浴20min 十+ 十十十+
20、-1-1-+ +十十十+什+十+结果(例全部溶血部分榕血全部不潜血附录C标准的附录)补体采集及其效价测定C1 补体采集选择健康豚鼠35只，于使用前天早晨喂饲前或停食后6h从心脏采血，分离血清后混合保存于普通冰箱中，也可从兽医生物药品厂购买冻于补体，使用前加稀释液恢复原量后使用。C2 补体效价测定每次补体结合试验，应于当日测定补体效价。C2.1 稀稀补体并加各种成分用稀释液配制1: 20稀释补体，按表Cl加入各种成分后，前后经37C38C20min水浴2次。C2.2 补体效价经过2次水浴，在2单位溶血素存在情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发
21、生完全溶血所需要最小补体量，就是所测得的补体效价。以表Cl为例，第6管1 20稀释的补体0.25mL即为一个补体单位。表Cl补体效价测定mL 对照管号2 3 4 5 6 7 B 9 10 11 12 13 1 20补体O. 10 O. 13 O. 16 。.19 O. 22 0.25 加入量0.28 0, 31 O. 34 O. 37 0.5 。稀释液0.40 0.37 0.34 O. 31 0.28 0.25 加入量0.22 O. 19 O. 16 。.13 1. 5 1. 5 2.0 1件量抗原加入量(不O. 5 0, 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 加抗原量加O. 5 O.
22、5 0.5 O. 5 。稀释液)10倍稀释阳O. 5 Q. 5 (阴)性血清O. 5 0.5 O. 5 。.5 。.5 0.5 O. 5 0, 5 。L一一.一194 GB/T 186462002 对照管号1 2 3 4 b 6 7 8 9 10 1 1 12 13 振荡均匀后置37C38(、7)(淄川mm 二单位O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 。O. 5 。溶血素2.5%红细O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 胞悬液振荡均匀后置37
23、C38(7)(浴20min 阳性血清4卡斗+十+十+十+十+十+十十十十+十十十+十十十十+十十十+十+ 加抗原阳性血清+十斗斗I I十+十+十卡十才t士H 不Jm抗原果阴性血清十+十十十+十+十十+ 加抗原阴性血清+十+十十十+十+十十+十不加抗原表C1(完)I I I -C3 原补体使用时应稀释倍数的计算原补体使用时应稀释倍数按式(Cl)计算:补体稀释倍数原补体应稀释倍数=一部荐夜奋一使用时每管加入最. ,. . . . ( C 1 ) 20 以表Cl为例，按公式计算一十XO.5=40倍。O. 25 即此例补体应作40倍稀释，每管加0.5mL.即为一个补体单位。考虑补体性质不稳定，操作过程
24、中效价会降低，正式试验时使用浓度比补体效价要大10%左右，本例补体工作单位应作1: 36稀释，每管使用。5mL 附录D(标准的附录)抗原效价测定一般按照兽医制药厂产品说明书的效价使用。在初次使用或过久等其他原因需要测定时按下述步骤迸行。01 须取用两份阳性血清(分别为强阳性和弱阳性血清)和一份阴性血清来测定抗原效价。02 阴性血清和阳性血清稀释用稀释液对阴性对照血清仅作1 10稀释，阳性血清稀释成1: 1 0、1 25、1: 50、1: 75和1: 100.5 个稀释度。03 稀释抗原则稀释液将抗原稀释成1: 10、1: 50、1 75、1: 100、1: 150、1 200、1: 300、1
25、: 400和1 500等稀释度。04 按表)J加人各种成分，并经37C38C20 min水浴2次。195 GB/T 18646-2002 表Dl布鲁氏菌补体结合抗原效价测定管号1 2 3 4 5 6 7 抗原稀释倍数加入量10 50 75 100 150 200 300 0.5 。.5 。5O. 5 。.5 0.5 O. 5 各种血清稀释度加人量O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 工作量补体O. 5 O. 5 o. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 37t:38C水裕20min 二个单位溶血章O. 5 O. 5 0.5 O. 5 O. 5 O. 5
26、O. 5 2.5%红细胞O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 37巳38C水浴20min 1比记录抗原测定结果从水浴中取出反应管，观察溶血百分数，记录结果。例举范例如表D208 9 400 500 0.5 0.5 O. 5 O. 5 O. 5 O. 5 0.5 O. 5 O. 5 O. 5 表D2布鲁氏菌补体结合抗原效价滴定结果(举例)抗原稀待倍数10 50 75 100 150 200 10 100 。25 100 。血清稀静倍数50 100 10 。75 100 50 20 。100 100 80 50 20 10 20 D6 抗原效价mL 对照10 11
27、补体对照浴血素对照0.5 。O. 5 。-丑O. 5 O. 5 O. 5 300 400 500 。10 20 20 30 80 80 80 100 抗原对阴性血清应完全溶血。对两份阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价。在正式试验时，抗原的稀释度应比测定的效价浓25%。以表D2为例，其效价为1I 150，正式试验时按1112.5稀释使用。附豪E(提示的附录)试提集试验，瓢比法管的制备每次试验须配比浊管，作为判定凝集反应程度的依据，先将20倍稀释抗原用等量稀释液作对倍稀释，然后按表El配制比浊管。表El参照比浊管的配制管号1 I 40稀释抗原液稀释波清亮度记录标记mL %
28、mL 1 0.00 1. 00 100 +十+2 O. 25 O. 75 75 + 3 0.50 0.50 50 十十4 0.75 0.25 2: + 5 1. 00 0.00 。196 GB/T 186462002 附录F(提示的附录)溶血程度的标准比色管的配制配制方法如表Fl.牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。表Fl标准比色管的配制方法及反应判定标准m 溶血程度/%。10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 溶血溶液u。0.25 0.50 O. 75 1.00 . 25 1. 50 1. 75 2.00 2.25 2.50 2.5%红细胞液0.50 0.45 o. 40 o. 35 o. 30 0.25 O. 20 O. 15 o. 10 O. 05 。稀释液2.00 . 80 1.60 1. 40 . 20 1.00 。.800.60 0.40 0.20 。判定符号十+十+十十十+十+十+ 十+十+ + 判定标准阳性可疑阴性1)试验中全溶血的试管内液体即为溶血榕液197
