1、GB/T 18652-2002 前言嗜水气单胞菌在自然界中广泛分布，有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病性菌株可感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类等动物，包括僻、团头筋、链、蝙、鲤、续、革鱼、香鱼、狼量卢、虹鳞、尼罗罗非鱼、斑点叉尾、黄鳝、日本馒、欧洲鲤、翘嘴獗、牛蛙、美洲鳝、中华鳖、箱、箱、兔、猪、牛等。临床上以急性出血性败血症为主要特征。慢性感染则主要表现为皮肤溃荡或肠炎。人亦可因致病性嗜水气单胞菌感染而发生腹泻及食物中毒。本标准在嗜水气单胞菌的鉴定中，参考了伯杰氏鉴定细菌学子册)(第丸版.1994)中有关嗜水气单胞菌的内容。在嗜水气单胞菌的分离鉴定中，除采用选择培养基RS培养基及鉴别
2、培养基嗜水气单胞菌(AHM)培养基外，还应借助一些生化反应将其与假单胞菌、邻单胞菌、肠杆菌、弧菌及其他气单胞菌进行区分。蛋白酶是嗜水气单胞菌重要的毒力决定因子，与该菌的致病性密切相关，凡蛋白酶阳性的嗜水气单胞菌均具致病性。蛋白酶的检测除采用脱脂奶平板法外，还可采用斑点酶联免疫试验。本标准可用于嗜水气单胞菌的分离鉴定，而且可区分致病性菌株和非致病性商株，有助于致病性嗜水气单胞菌感染的确切诊断。本标准的附录A、附录B是标准的附录，附录C是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位南京农业大学动物医学院。本标准主要起草人.陆承平、陈怀青。2
3、19 中华人民共和国国家标准GB/T 8652-2002 致病性嗜水气单胞菌检验方法Methods for detection of pathogenic aero脑lonashydrophila 1 范围本标准规定了致病性嗜水气单胞菌的检验方法。本标准适用于患病鱼类等易感动物及水样中致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定，也可用于送检菌株的鉴定。2 致惰性晴水气单胞菌检验程序检验程序的流程示意图见附录C(提示的附录)。2. , 嗜水气单胞酶的分离2. ,. , 准备2. 各种培养的制备方法见附录A(标准的附录)。2. 1-,. 2 各种试剂的制备方法见附录以标准的附录)。2. ,. 2 待检样本待检
4、样本可包括病料、水样反送检菌株，病料既可是完菌采取的易感动物的肾、肝、脾等未污染病料，也呵是粪便或病变皮肤等污染病料，如样本为菌株，应先接种子普通肉汤(见附录A中Al)，28C培养24h，再划线接种于普通琼脂平板(见附录A中A2)，使之形成单个菌落，以供鉴定用。2. ,. 3 分离2. 3- 未污染病料的分离2.3. 接种环(铀金耳)火焰灭菌，冷却。2.3.1.2 用接种环蘸取病料。2.1.3.3 U线接种于普通琼脂平板。2. ,. 3. .4 28 C培养24人2. 3- 2 污染病料的分离2.1. 3- 2. 接种环(铅金耳)火焰灭菌，冷却。2. 3. 2.2 用接种环蘸取病料。2.1.3
5、.2.3 接种于RS琼脂平板(见附录A中A3)。2. 1. 3. 2. 4 28 C培养24h 0 2.3.3 水样的分离2.1.3. 3. 1 用孔径为O.2m的硝酸纤维素微孔滤膜过滤水样。2.3. 3. 2 取出滤膜，置含有灭菌碱性蛋白腺水(见附录A中A4)的试管中。2. ,. 3. 3. 3 28 C培养24h。2.1. 3.3. 4 划线接种于普通琼脂平板。2.3.3.528C培养24h 0 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002- 02 -19批准220 2002 - 05 -01实施2.2 嗜水气单胞菌的鉴定2.2.1 菌落形态GB/T 18652-2002 嗜水气单胞菌在
6、普通琼脂平板上，28.C培养24h后的菌落为光滑、微凸、圆整、元色或淡黄色，有特殊芳香气味。2.2.2 氧化酶试验2.2.2.1 用铅金耳挑取普通琼脂平板上单个菌落少许。2.2.2.2 涂布于浸有1%盐酸四甲基对苯胶见附录B中Bl)的滤纸片上。2.2.2. 3 10 s内观察细菌涂布处的颜色。2.2.2.4 若细菌涂布处出现红色，判为阳性。2.2.2.5 嗜水气单胞菌应为阳性。2.2.3 AHM鉴别培养2.2.3.1 用钥金耳挑取普通琼脂平板上氧化酶试验阳性的单个菌落少许。2.2.3.2 穿刺接种AHM鉴别培养基(见附录A中A5)。2. 2. 3. 3 37 C培养24ho 2.2. 3. 4
7、 嗜水气单胞商的表现为顶部仍为紫色，底部为淡黄色;细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳性3部分菌株顶部皇黑色。2.2.4 崎|噪试验2.2.4.1 在长有细菌的AHM鉴别培养基顶部，滴加34滴Kovacs试剂(见附录B中Bl)。2.2.4.2 若沿试管内壁出现红色环者，表明产生蚓噪，判为阳性.2.2牛3嗜水气单胞菌应为阳性。2.2.5 革兰民染色2.2.5.1 在一干净载玻片上滴加一滴蒸锢水。2.2.5.2 用铀金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。2.2.5.3 在载玻片上与蒸馆水混合并均匀涂布。2.2.5.4 自然于燥，火焰固定。2.2.5.5 加草酸镀结晶紫染液(见附录B中B2)染1min-
8、2 mno 2.2.5.6 流水冲洗。2.2.5.7 加革兰氏腆液(见附录B中B3)作用1min_ 2 min。2.2.5.8 流水冲洗。2.2.5.9 加复红酒精染液(见附录B中84)染50s60 s 。2.2.5.10 流水冲洗。2.2.5.11 干燥，镜检。2.2.5.12 嗜水气单胞菌应为革兰氏阴性短杆菌。2.2.6 糖发酵试验2. 2. 6. 1 用铅金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。2.2.6.2 分别接种葡萄糖、，1;糖、阿拉伯糖、七叶昔及水杨背等5种糖发酵试验管(见附录B中B5)。2.2.6. 3 28 C培养24ho 2.2.6.4 凡试验管颜色从紫色变为黄色，表明细菌可发
9、酵该种糖类，妻IJ为阳性。2.2.6.5 嗜水气单胞菌可发酵以上5种糖类。2.3 嗜水气单胞菌致病性鉴定2. 3. 1 脱脂奶平板试验2.3.1. 用销金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。2.3.2 接种划线于1%脱脂奶，1;糖膜蛋白陈平板(见附录A中A6)。ZZl GB/T 18652-2002 2. 3.1- 3 28C培养24h。2. 3.1- 4 若菌落周围出现清晰、透明的溶蛋白圃，判为阳性。2. 3. 2 斑点酶联免疫试验2. 3. 2.1 用锦金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。2. 3. 2.2 接种w.糖膜蛋白陈肉汤(见附录A中A7)。2. 3. 2. 3 28 C摇床(30r
10、/min)培养48ho 2.3.2.4 10000 r/min离心10min，取上清。2.3.2.5 用微量加样器取5L点样于硝酸纤微素膜光面。2. 3. 2. 6 37 C烘干。2. 3. 2.7 置20%脱脂奶中.37C封闭1h。2. 3. 2.8 用含吐温20的磷酸盐缓冲液(见附录B中B6)洗5次，每次2min。2. 3. 2.9 置1: 50兔抗嗜水气单胞菌蛋白酶抗血清中.37CC作用1ho 2. 3. 2.10 用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗5次，每次2minc 2. 3. 2.11 置1: 10酶标羊抗兔抗血清中.37C作用1h 0 2. 3. 2.12 用含吐温20的磷酸盐缓冲液
11、洗5次，每次2min。2. 3. 2.13 加3.3-二氨基联苯胶-过氧化氢(见附录B中B7)中显色。2. 3. 2.14 待斑点明显后，用去离子水终止显色。2. 3. 2.15 设无菌肉汤作阴性对照。2.3.2.16 以出现明显棕色斑点者判为阳性。3 试验结果分析判定符合以下特性者应判为致病性嗜水气单胞菌a)在普通琼脂平板上.28C培养24h后的菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄色，有特殊芳香气味;b)在AHM鉴别培养基中，顶部仍为紫色，底部为淡黄色;细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳性;部分菌株顶部呈黑色gc)氧化酶试验阳性，革兰氏染色为阴性短杆菌gd)呵|味试验阳性，发酵葡萄糖、煎糖、阿
12、拉伯糖、七叶背及水杨11等5种糖类pu脱脂奶平板试验阳性或斑点酶联免疫试验阳性。222 GB/T 18652-2002 附录A(标准的附录)各种培养基的配制方法A1 普通肉汤牛肉膏3.0 g 蛋白陈10.0 g 氯化纳(NaCI)5.0 g 磷酸二氢钳(KH2PO.)1. 0日蒸饱水1 000 mL 混匀，加热溶解，调pH至7.6，分装，112kPa高压灭菌15min , A2 普通琼脯平板牛肉膏3.0 g 蛋白陈10.0 g 氯化饷(NaCI)5.0 g 磷酸二氢梆(KH2PO.)1.0 g 琼脂15.0 g 蒸馈水1 000 mL 1昆匀，加热溶解，调pH至7.6，分装，112kPa高压灭
13、菌15min，冷却至45C倾注灭菌平板.A3 RS琼脂平板L盐酸鸟氨酸L-盐酸赖氨酸L盐酸半脱氨酸麦芽糖硫代硫酸纳(Na2S，o， 5H20) 拘橡酸铁胶脱氧胆酸销氯化锅(NaCI)酵母提取物新生霉素澳廓香草酣兰琼脂蒸馆水6.5 g 5.0 g 0.3 g 3.5 g 6.8日0.8 g 1.0 g 5.0 g 3.0 g O. 005 g 0.03 g 13.5 g 1 000 mL 混合溶解，调pH至7.0，煮沸1min，冷却至45C ，倾注灭菌平板。A4 破性蛋白腺水蛋白自在氯化纳(NaCI)蒸馆水10.0 g 8.5 g 1 000 mL 223 GB/T 18652-2002 混匀，
14、加热溶解，调pH至9.0，分装，112kPa高压灭菌15mn 0 A5 AHM鉴别培养基蛋白陈5.0 g 酵母提取物3.0 g 膜蛋白陈10.0 g L盐酸鸟氨酸5.0 g 甘露醇1.0 g 肌醇10.0 g 硫代硫酸纳(Na，S，03 5H,) 0.4 g 拘橡酸铁胶。.5g 澳甲盼紫0.02 g 琼脂3.0 g 蒸锢水1 000 mL 混匀，加热溶解，调pH至6.7，分装，112kPa高压灭菌15mn 0 A6 脱脂奶蔚糖膜蛋白陈平板磷酸二氢惆(KH，PO，)10.0 g 氯化饵(KCD. 5 g 庶糖5.0 g 膜蛋白自在5.0 g 脱脂奶粉10.0 g 琼脂15.0 g 蒸馆水1 00
15、0 mL 混匀，加热溶解，调pH至7.0，分装，112kPa高压灭菌15min，l冷却至45C ，倾注灭菌平板。A7 藤糖膜蛋白腺肉汤磷酸二氢饵(KH，PO，) 10.0 g 氯化饵(KCD. 5 g 煎糖5.0 g 膜蛋白陈5.0 g 脱脂奶粉10.0 g 蒸馆水1 000 mL ?昆匀，加热溶解，调pH至7.0分装，112kPa高压灭菌15mm。224 81 Kovacs试剂对二甲基氨基苯甲醒戊醇浓盐酸82 草酸接结晶紫染液甲液:结晶紫溶于95%乙醇20mL 乙液:草酸钱溶于蒸馆水80mL。使用前将甲液和乙液混合。B3 革氏腆液腆(1，)腆化御(K，l)蒸馆水B4 复红酒精染液碱性复红95
16、%乙醇B5 糖发酵试验管GB/T 18652-2002 附录B(标准的附录)各种试jlJ配制方法5.0 g 75 g 25 mL 2.0 g 0.8 g 1. 0 g 2.0 g 100 mL 0.4 g 100 mL 先配蛋白陈水(蛋白陈5.0g.蒸馆水1000 mL.调pH至7.4.分装，每瓶100mL)。每100mL蛋白陈水中分别加入葡萄糖、煎糖、阿拉伯糖、七叶昔及水杨苛1.0 g.充分溶解，分装试管.106.44kPa高压灭菌10min , B6 含吐温-20的确醺盐缓冲液(PBSTl氯化纳(NaCl)氯化仰(KCl)8.0 g 0.2 g 磷酸氢二锅(Na2HPO.)1.44 g 磷
17、酸二氢梆(KH，PO.)O. 24日蒸馆水800 mL 调pH至7.4.加水定容至980mL，吐温-80(Tween-80)20mL。225 GB!T 18652-2002 B7 3.3-二氨基联苯胶-过氧化氢先配二经甲基氨基甲烧盐酸(Tris-HCl)缓冲液(氯化纳8.0g.氯化御。.2g , Tris3. 0 g，蒸馆水800 mL.调pH至7.4 ，加水定容至1000 mL)。Tris-HCl缓冲液50 mL 二氨基联苯胶250 mg 临用前取10mL用蒸馆水10倍稀释至100mL，加30%过氧化氢300L，水样础性置自酶水国陆拉1226 附录C(提示的附录)敖病性晴水气单胞菌检验程序无精暨南料植样污染病料l RS培养基i 普通琼庸平植l l氧化酶lI AHM编鼻基l 1 鉴定为嘈水气单跑酶中| 判定为藏南性嘈水气单胞| 图C1l菌株l1 普遍缩养l年平士i
