1、ICS 65150B 50 鳕亘中华人民共和国国家标准GBT 1 86541 32008养殖鱼类种质检验第1 3部分：同工酶电泳分析2008-06-27发布Inspection of germplasm for cultured fishesPart 1 3：Analysis of isozyme electrophoresis2008-10-01实施宰瞀鬻鬻黼警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会捉仲刖 舌GBT 18654(养殖鱼类种质检验分为下列部分第l部分：检验规则；第2部分：抽样方法；第3部分：性状测定；一第4部分：年龄与生长的测定；一一第5部分：食性分析；第6部分：繁殖性能的测定；一
2、第7部分：生态特性分析；第8部分：耗氧率与临界窒息点的测定；一一第9部分：含肉率测定；第lo部分：肌肉营养成分的测定；第11部分：肌肉中主要氨基酸含量的测定；第12部分：染色体组型分析；第13部分：同工酶电泳分析；第14部分：DNA含量的测定；第15部分：RAPD分析；本部分为GBT 18654的第13部分。本部分的附录A为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口。本部分起草单位：上海水产大学、中国水产科学研究院长江水产研究所。本部分主要起草人：李思发、赵金良、徐忠法、蔡完其、邹曙明。GBT 18654132008养殖鱼类种质检验第
3、13部分：同工酶电泳分析GBT 186541320081范围GBT 18654的本部分规定了鱼类同工酶聚丙烯酰胺凝胶水平电泳分析的试剂与材料、仪器和设备、抽样、分析步骤和结果判定。本部分适用于鱼类同工酶电泳分析。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 18654的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBT 186541 2002养殖鱼类种质检验第1部分：检验规则GBT 186542养殖鱼类种质检
4、验第2部分：抽样方法3原理同工酶为该酶基因产物的表现型，根据其所带电荷的不同和分子大小、形状的不同，在电场和凝胶中出现各同工酶组分不同的迁移率，经催化、染色、扫描，根据酶带迁移距离、数目及吸收强度进行分析比较，判定鱼类物种、种群的遗传特性。4试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。41丙烯酰胺(Arc)。42 N，N-亚甲基双丙烯酰胺或甲叉双丙烯酰胺(Bis)。43四甲基乙二胺(TEMED)。44过硫酸胺。45三羟甲基氨基甲烷(Tris)。46柠檬酸。47 乙二胺四乙酸(EDTA)。48硼酸。49 L-组氨酸。410乳酸。411 DL_苹果酸。
5、412 a一磷酸甘油钠。413磷酸氢二钠(Na。HPO；)。414 二个结晶水的磷酸二氢钠(NaHzPO。2HzO)。415辅酶I(NAD)。416辅酶(NADP)。1GBT 18654132008417吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)。418氯化硝基四氮唑蓝(NBT)。419山梨醇。420 DL一异柠檬酸三钠。421 6一磷酸葡萄糖酸钠。422 p乙酸萘酯。423 p乙酸萘酯。424丙酮。425坚牢蓝RR盐。426氨基黑10B。427 95乙醇。428盐酸(HCl)。429氢氧化钠(NaoH)。430固定液：3份乙醇，加1份冰乙酸，加1份甘油，加5份蒸馏水，混合均匀。431 TC制胶缓冲液：三羟甲基
6、氨基甲烷3028 5 g，用柠檬酸调至pH80，蒸馏水定容至1 L。432 EBT制胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷5451 3 g、EDTA 0292 2 g，用硼酸调节至pH86，蒸馏水定容至1 L。433 HC制胶缓冲液：组氨酸1939 5 g、柠檬酸21014 g，用5NaOH调至pH82，蒸馏水定容至1 L。434 TC电极缓冲液：三羟甲基氨基甲烷4865 g，用柠檬酸调pH至80，蒸馏水稀释至10 L。435 EBT电极制胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷654 g、EDTA 351 g，用硼酸调至pH86，蒸馏水稀释至15 L。436 HC电极制胶缓冲液：组氨酸1939 5 g、柠檬酸2101
7、4 g，用5NaOH调pH至85，蒸馏水稀释至10 L。437 ArcBis液：丙烯酰胺98 g、N7，N7一亚甲基双丙烯酰胺2 g，用蒸馏水溶解并定容到500 mL。438 25TEMED：TEMED 25 mL，加入75 mL蒸馏水。439 i00 mgmL过硫酸胺：过硫酸胺01 g，溶解于1 mL蒸馏水中。440 4聚丙烯酰胺凝胶：ArcBis液132 mL、制胶缓冲液147 mL、蒸馏水375 mL、25TEMED 03 mL、10过硫酸胺06 mL，混匀后，立即灌注到凝胶模具中，聚合反应结束后，取出凝胶，放在保湿盒内备用。441 15 molL TrisHCI(pH80)：三羟甲基氨
8、基甲烷18171 g，用HCI调至pH80，蒸馏水稀释至1 L。442 15 molL Tris-HCl(pH95)：三羟甲基氨基甲烷18171 g，用HCI调至pH95，蒸馏水稀释至1 L。443 01 molL磷酸缓冲液：NaH。PO。2H。O 516 g、Na。HPO；142 g，蒸馏水溶解并定容至1 L。444染色液：几种常见同工酶染色液的配制方法见附录A。5仪器与设备51微量匀浆机：转速4 000 rmin。52高速冷冻离心机：转速15 000 rmin以上，冷冻温度为4。53多用电泳仪。54激光扫描仪。55 pH计：读数值001。2GBT 1865413200856微量加样注射器。
9、57制胶模具。58染色缸。59低温冰箱：冰室温度在一30以下。510恒温培养箱。511分析天平：感量为0000 1 g。512电子天平：感量为01 g。513照相机。6抽样61 活体样品鱼的抽样按GBT 186542的规定执行，样品鱼数量为30尾以上。62取样活体解剖样品鱼，按被检鱼类种质标准所规定的组织取1 g2 g试样，放入编号的小塑料袋中；对于血液试样用注射器从鱼的尾动脉抽血，分离出血清。样品均需置于低温冰箱中保存备用。7分析步骤71分析样品的制备取03 g样品，以1份试样加入3份体积的03NAD液，于匀浆机中以4 000 rmin匀浆2 rain，粉碎组织。用吸管将匀浆后的样品移人指管
10、中，在冷冻离心机中以15 000 rrain离心直至上清液澄清，以上操作均在4低温下进行。制备后样品于冰箱中暂存或直接电泳。72凝胶制备凝胶制备按试剂和材料中440的规定执行。73电泳步骤731每次实验前，先打开多用恒温循环仪，冷却至4左右。732预电泳：依酶的种类不同，采用相应的凝胶缓冲系统。并将预先制备的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却板上，在50 mA电流下，电泳30 min。733前电泳：预电泳结束后，用微量加样器在凝胶的点样槽中加入8 pL的分析样品，在25 mA电流下，电泳10min。734正式电泳：在适当的电压下恒压电泳，电泳时间依酶的种类而定。74染色、脱色和固定741 染色：将电泳胶放
11、人预先配制并在37恒温箱中保温所需检测酶的染色液中染色。当酶带全部显示清晰时，停止染色。742脱色：在25冰乙酸中脱色至凝胶背景清晰、透明。743固定：脱色后的电泳胶放入乙醇一冰乙酸一甘油一水的混合液中，其混合比例为3：1：1：5，固定数小时。75制干胶片取与凝胶板大小适中的玻璃纸，浸泡湿润后，平铺在凝胶板上，排空气泡，四周向下包紧。在室温下自然风干，制成透明胶片，编号保存。76摄影、扫描用近镜头对凝胶及其谱带照相，用激光扫描仪对电泳谱带进行扫描，计算同工酶各组分的相对含量。3GBT 1865413200877结果分析771酶位点与等位基因分析：根据酶的结构组成和同工酶在组织中所表现的酶谱特征
12、，确定每种同工酶的编码基因位点、多态位点的等位基因频率。772群体遗传异质性用多态座位比例(P)和平均杂合度(H)来度量，分别按式(1)和式(2)计算：Pnl100 (1)nH一(1一X。2)n (2)式中：P多态座位比例，；n，多态座位数；n所测基因总座位数；H平均杂合度；x，等位基因i的频率。8结果判定81个体测定结果的判定按GBT 186541 2002中61的规定执行。将所有测定结果逐一与标准对照，凡符合标准规定的判定为合格；凡不符合标准或与标准规定有显著差异的判定为不合格。82样品群体的判定根据81的判定结果，计算出被检样品中合格品的百分率，用表示。附录A(规范性附录)几种常见同工酶
13、的染色配制方法表A1 几种常见同工酶的染色配制方法GBT 18654132008辅酶I 辅酶 1 mgmL PMS同工酶 染色缓冲液 NAD NADP NErr 其他试剂mgmg mg mL醇脱氢酶 025 molL TrisHCl22 105 105 95乙醇45 mLADH pH80140 n1L十乙酸萘酯20mg酯酶 01 molL磷酸缓冲 卢_乙酸萘酯20mgEST 液，150 mL 丙酮1 mL坚牢蓝RRl00mg甘油一3磷酸脱氢酶 025 molL TrisHCl 1 molL甘油磷酸钠45 2l 105矿GPDH pH95，114 mL 15 mL山梨醇脱氢酶 025 molL
14、TrisHCl22 105 105 山梨醇3 gSDH pH80，140 mL异柠檬酸脱氢酶 1s molL TrisHCI异柠檬酸钠400 mg10 30 105 IVgC2 150 mgIDH pH9515 mL蒸馏水105mL乳酸脱氢酶 15 molL TrisHCl 1 molL乳酸钠10 mL30 30 105LDH PH95，15 mL 蒸馏水95 mL苹果酸脱氢酶 15 molL TrisHCl 1 molL苹果酸钠15 mL30 30 105MDH pH95，15 mL 蒸馏水90mL苹果酸酶 15 molLTrisHCl 1 molL苹果酸钠15 mL40 30 105ME pH80，15 mL 蒸馏水90mL6一磷酸葡萄糖脱氢酶 025 molL Tris-HCl15 105 105 6一磷酸葡萄糖酸钠75 nag6一PGDH pH80140 mL超氧物歧化酶 05 molL Tris-HCl40 315 315SOD pH95，118 mL5
