1、ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 18869-2002 饲料中大肠菌群的测定Determination of coliform bacteria in feeds 2002- 09-24发布2003 - 03 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局GB/T 18869-2002 前言本标准在查阅大量资料文献和样品检测的基础上制定。本标准的制定其技术内容主要依据GB4789.3-1994(食品卫生微生物学检验大肠菌群测定。本标准的附录A、附录B均为规范性附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标
2、准由国家饲料质量监督检验中心(北京)负责起草。本标准主要起草人:李丽蓓、饶正华、杨曙明、高生。GB / T 18869- 2002 饲料中大肠菌群的测定警告一二使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。具备适当设备的实验室才能承担检验。应小心处理所有废弃物。范围2 规范性引用文件修改单(不包括勘误否可使用这些文件3 4 e)生理盐水。f)革兰氏染色液:5 仪器、设备5. 1 培养箱:36CC士1cC。5. 2 显微镜:普通生物显微镜。5. 3 均质器或乳钵。5.4 平皿:直径为90mm o 5. 5 试管。5. 6 吸管:1mL。5. 7 广口=角瓶:容量为500mL。5. 8 玻璃珠:直
3、径约5mm。5. 9 载玻片。h，根据确证试验为GB/T 18869一20025.10 酒精灯。5.11 试管架。6 采样按照GB/T14699. 1的要求执行。采样器具要灭菌消毒。7 分析步骤(见附录B)7.1 检样稀释7.1.1 以无菌操作将试样25g(或mL)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1: 10的均匀稀释液。固体成样最好用均质器，以8000 r/min10 000 r/min的速度处理1min，做成1: 10的均匀稀择液。7.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1: 10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生
4、理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管棍匀，做成1: 100的稀释液。7.1.3 另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释，每递增稀释一次，换用一支1mL灭菌吸管。7.1.4 根据对试样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。7.2 乳糖发酵试验将待检试样接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1 mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36C :I: 1 c培养箱内，培养24h :I: 2 h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。7.3 分离培养将产气的发酵管分别转接种在伊
5、红美蓝琼脂平板上，置36C士1C培养箱内，培养18h24 h，然后取出，观察菌落形态，并做确证试验。7.4 确证试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1个2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36C :I:1C培养箱内培养24h士2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽抱杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。7.5 报告根据确证为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表(表1)，报告每100g(mL)试样中大肠菌群的最大可能数，以个/100g(mL)表示。表1大肠菌群最大可能数(MPN)检索表阳性管数aMPNh 95%可信限1mL(g)X3 0.1 mL(g) X 3 0.01 mL(g
6、) X 3 (100 mL(g)试样上限下限。30 。1 30 5 90 。2 60 。3 90 。1 。30 。l l 60 5 130 。1 2 90 。1 3 120 2 GB/T 18869-2002 表1(续)阳性管数目MPNb 95%可信限1 mL(g)X3 0.1 mL(g)X3 0.01 mL(g) X 3 (100 mL(g)试样上限下限。2 。60 。2 1 90 。2 2 120 。2 3 160 。3 。90 。3 130 。3 2 160 。3 3 190 。40 5 200 l 。1 70 10 210 1 。2 110 1 。3 150 1 I 。70 10 23
7、0 l 1 1 110 30 360 1 2 150 1 1 3 190 1 2 。110 30 360 1 2 1 150 1 2 2 200 2 3 240 3 。160 1 3 1 200 l 3 2 240 3 3 290 2 。90 10 360 2 。1 140 30 370 2 。2 200 2 。3 260 2 。150 30 440 2 1 200 70 890 2 1 2 270 2 3 340 2 2 。210 40 470 2 2 1 280 100 1 500 2 2 2 350 2 2 3 420 2 3 。290 2 3 1 360 2 3 2 440 2 3 3
8、 530 3 。230 10 1 200 3 。1 390 70 1 300 3 。2 640 150 3800 3 。3 950 3 GB / T 18869- 2002 阳性管数a1 mL(g) X 3 0.1 mL(g) X 3 3 3 3 3 1 3 2 3 2 3 2 3 2 3 3 3 3 4 表1(续)MPNb 0. 01 mL(g) X 3 000 mL(g)试样上限。430 70 1 750 140 2 1 200 300 3 1 600 。930 150 1 1 500 300 2 2 100 350 U zx m 710 1 500 95%可信限下限2 100 2 300
9、 3800 3800 4400 4 700 13 000 24000 48000 降低10倍;如改用o.1 推。附录A(规范性附录)试剂和培养基制备以下培养基的制备按GB4789.28-1994的规定。A.1 乳糖胆盐发酵培养基A. 1. 1 成分蛋白陈高压灭菌15min。注:双料乳糖胆盐A.2 伊红美蓝琼脂A.2.1 成分蛋白陈pH7.1 A. 2. 2 制法、将蛋白陈、磷酸盐和琼脂海解A.3 军L糖发酵培养基A. 3. 1 成分蛋白陈乳糖0.04%澳甲酣紫水溶液蒸馆水pH7.4 A. 3. 2 制法20 g 10 g 25 mL 1 000 mL GB/ T 18869- 2002 将蛋白
10、陈及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30mL、10mL或3mL，并放入5 GB/T 18869-2002 一个小导管，115C高压灭菌15min。注2双料乳糖发酵管除蒸馆水外，其他成分加倍。3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。A.4 磷酸盐缓冲撞A.4.1 储存液磷酸二氧梆c(NaOH)=1 mol/L氢氧化铀榕液蒸俑水pH7.2 34 g 175 mL 825 mL A.4.2 制法先将磷酸盐溶解于500mL蒸馆水中，用1mol/L氢氧化铀溶液校正pH后，再用蒸馆水稀释至1 000 mL。A.4.3 稀释液:取储存液1.25mL，用蒸馆水稀释至1000mL。分装每瓶100
11、mL或每管10mL , 121 C 高压灭菌15min。A.5 革兰氏染色法A.5.1 结属紫染色灌结晶紫1 g 95%乙醇20 mL 10 g/L草酸镀水溶液80 mL 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸镀榕液棍合。A.5.2 革兰氏破液腆1g 腆化伺2g 蒸榴水300 mL 将腆与腆化梆先进行混合，加入蒸馆水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馆水至300mL A. 5. 3 沙黄复染液沙黄0.25 g 95%乙醇10 mL 蒸馆水90 mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸锢水稀释。A.5.4 染色法A. 5. 4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。A. 5. 4.
12、2 滴加革兰氏腆液，作用1min，水洗。A. 5.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s 。A. 5.4.4 水洗，滴加复染液，复染1min。水洗，待干，镜检。A. 5.4. 5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注:亦可用1, 10稀释石炭酸复红染色浓作复染液，复染时间仅需10s。6 大肠菌群检验步骤见图B.l。I *if I 附录B(规范性附录)大肠菌群检验程序伊红美蓝琼脂平板I *1!f I 固B.1大肠菌群测定步骤圈GB/T 18869-2002 NOON-s 回阁。国华人民共和国家标准饲料中大肠菌群的测定GB/T 18869-2002 中4峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售68517548 4唾开本880X12301/16 印张3/4字数15千字2003年2月第一版2003年2月第一次印刷印数1-1500 句俗7巳定价10.00网址书号:155066 1-19109 略630-458 版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533科目
