1、ICS 67120X 22 雷园中华人民共和国国家标准GBT 223382008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定Determination of multiresidues of chloramphenicolsin animaloriginal food2008-09-0 1发布 2008-12-01实施宰瞀鬻紫瓣警攒瞥星发布中国国家标准化管理委员会厘111刖 置GBT 223382008本标准的附录A、附录B、附录C、附录D和附录E均为资料性附录。本标准由中华人民共和国质量监督检验检疫总局提出。本标准由国家认证认可监督管理委员会归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和
2、国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邱月明、林黎明、李鹏、张鸿伟、赵海香、董益阳、蔡慧霞、谢孟峡、汪丽萍、孔莹。动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定GBT 22338-20081范围本标准规定了动物源性食品中氯霉素类残留量的气相色谱一质谱和液相色谱一质谱质谱测定方法。本标准适用于水产品、畜禽产品和畜禽副产品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素残留的定性确证和定量测定。2气相色谱一质谱法21原理样品用乙酸乙酯提取，4氯化钠溶液和正己烷液一液分配净化，再经弗罗里硅土(Florisil)柱净化后，以甲苯为反应介质，用N，0双(三甲基硅基)三氟乙酰胺一三甲基氯硅烷(BSTFA+TMCS，99+1)于7
3、0硅烷化，用气相色谱负化学电离源质谱测定，内标工作曲线法定量。22试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和二次去离子水或相当纯度的水。221甲醇：色谱纯。222甲苯：农残级。223正己烷：农残级。224乙酸乙酯。225乙醚。226氯化钠。227氯霉素(cAP)、氟甲砜霉素(FF)、甲砜霉素(TAP)标准物质：纯度99。228间硝基氯霉素(mcAP)标准物质：纯度99。229氯化钠溶液(4)：称取适量氯化钠用水配置成4的氯化钠溶液，常温保存，可使用1周。2210氯霉素类标准储备溶液：准确称取适量氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素标准物质(精确到01 mg)，以甲醇配制成浓度为100
4、pgmL的标准储备溶液。2211 间硝基氯霉素内标工作溶液：准确称取适量问硝基氯霉素标准物质(精确到01 rag)，用甲醇配制成10 ngmL的标准工作溶液。2212氯霉素类基质标准工作溶液：选择不含氯霉素类的样品六份，分别添加1 mL内标工作溶液(2211)，用这六份提取液分别配成氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素浓度为01 ngmL、02 ngmL、1 ngmL、2 ngmL、4 ngmL、8 ngmL的溶液，按本方法提取(241)、净化(242)，制成样品提取液，用氮气缓慢吹干，硅烷化(243)后，制成标准工作溶液。2213衍生化试剂：N，o双(三甲基硅基)三氟乙酰胺一三甲基氯硅烷(BSTFA
5、+TMCS，99+1)。2214固相萃取柱：弗罗里硅土柱(60 mL，10 g)。23仪器和设备231 气相色谱质谱联用仪：配有化学电离源(cI)。232组织捣碎机。1GBT 22338-2008233固相萃取装置。234振荡器。235旋转蒸发仪。236涡旋混合器。237离心机。238恒温箱。24测定步骤241提取称取10 g(精确到001 g)粉碎的组织样品于50 mL具塞离心管中，加入10 mL内标溶液(2211)和30mL乙酸乙酯，振荡30rain，于4 000 rrain离心2min，上层清液转移至圆底烧瓶中，残渣用30 mL乙酸乙酯再提取一次，合并提取液，35旋转蒸发至1 mL2 m
6、L，待净化。242净化2421液一液萃取提取液浓缩物(241)加1 mL甲醇溶解，用20 mL氯化钠溶液(229)和20 mL正已烷液一液萃取，弃去正己烷层，水相用40 mL乙酸乙酯分两次萃取，合并乙酸乙酯相于心形瓶中，35旋转蒸发至近干，用氮气缓慢吹干。2422弗罗里硅土柱净化弗罗里硅土柱依次用5 mL甲醇、5 mL甲醇一乙醚(3+7)溶液和5 mL乙醚淋洗备用。将残渣(2421)用50 mL乙醚溶解上样，用50 mL乙醚淋洗Florisil柱，50 mL甲醇一乙醚溶液(3+7)洗脱，洗脱液用氮气缓慢吹干，待硅烷化。243硅烷化净化后的试样(2422)用02 mL甲苯溶解，加入01 mL硅烷
7、化试剂(2213)混合，于70衍生化60 rain。氮气缓慢吹干，用10 mL正己烷定容，待测定。244测定2441气相色谱一质谱条件a)色谱柱：DB-5MS毛细管柱，30 m025 mm(内径)025 p-m，或与之相当者；b)色谱柱温度：50保持1 min，25min升至280，保持5 min；c)进样口温度：250；d)进样方式：不分流进样，不分流时间075 rain；e)载气：高纯氦气，纯度99999；f)流速：10 mLmin；g)进样量：10 pL；h)接口温度：280；i) 离子源：化学电离源负离子模式NCI；j)扫描方式：选择离子监测；k)离子源温度：150；1)四级杆温度：1
8、06；m)反应气：甲烷，纯度99999；n)选择监测离子参见表1。表1监测离子GBT 22338-2008药物名称 监测离子(mz) 定量离子(mz) 相对离子丰度比 允许相对误差466 100468 66 士20问硝基氯霉素 466470 16 土30432 2 土50466 100468 71 土20氯霉素 466376 32 士25378 19 士30339 i00341 75 土20氟甲砜霉紊 339429 89 土20431 84 土20409 100411 93 士20甲砜霉素 409499 92 20501 93 土202442定性测定进行试样测定时，如果检出色谱峰的保留时间与标
9、准物质相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择离子的相对离子丰度比与标准物质一致，相对丰度允许偏差不超过表1规定的范围，则可判断样品中存在对应的三种氯霉素。如果不能确证，应重新进样，以扫描方式(有足够灵敏度)或采用增加其他确证离子的方式来确证。2443内标工作曲线用配制的基质标准工作溶液(2212)按2441的气相色谱一质谱条件分别进样，以标准溶液浓度为横坐标，待测组分与内标物的峰面积之比为纵坐标绘制内标工作凸线。2444定量以mz466(m-CAP和CAP)、339(FF)和409(TAP)为定量离子，样品溶液中氯霉素类衍生物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。
10、在上述色谱条件下(2441)，m-CAP、CAP、FF、TAP标准物质衍生物参考保留时间约为114 min、118 min、126 min、136 min。氯霉素类标准物质衍生物总离子流图和质谱图参见附录A中的图A1和图A2。245平行实验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。246空白实验除不加试样外，均按上述测定步骤进行。25结果计算结果按式(1)计算：X：c XV式中：X试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从内标标准工作曲线上得到的被测组分浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；y试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m试样的质量，单位为克(g)。3GBT 22338-2
11、00826测定低限气相色谱一质谱测定低限为：氯霉素01 pgkg，氟甲砜霉素和甲砜霉素05 pgkg。27回收率和精密度参见附录B。3液相色谱一质谱质谱法31原理针对不同动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留，分别采用乙腈、乙酸乙酯一乙醚或乙酸乙酯提取，提取液用固相萃取柱进行净化，液相色谱一质谱质谱仪测定，氯霉素采用内标法定量，甲砜霉素和氟甲砜霉素采用外标法定量。32试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和二次去离子水或相当纯度的水。321 甲醇：液相色谱级。322乙腈：液相色谱级。323丙酮：液相色谱级。324正丙醇：液相色谱级。325正已烷：液相色谱级。326乙酸
12、乙酯：液相色谱级。327乙醚。328乙酸钠。329乙酸铵。3210 p葡萄糖醛酸苷酶：约40 000活性单位。3211乙腈饱和正己烷：取200mL正己烷(325)于250mL分液漏斗中，加入少量乙腈(322)，剧烈振摇，静置分层后，弃去下层乙腈层即得。3212丙酮一正己烷(1+9)：丙酮(32，3)，正己烷(325)按体积比I：9混匀。3213丙酮一正己烷(6+4)：丙酮(323)、正己烷(325)按体积比6：4混匀。3214 乙酸乙酯一乙醚(75+25)：75 mL乙酸乙酯(326)与25 mL乙醚(327)溶液混匀。3215乙酸钠缓冲液(o1 toolL)：称取乙酸钠(328)136 g于
13、l 000 mL容量瓶中，加入980 mL水溶解并混匀，用乙酸调pH到50，定容至刻度混匀。3216 乙酸铵溶液(i0 mmolL)：称取乙酸铵(329)077 g于1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度混匀。3217氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质：纯度990。3218氯霉素氘代内标(氯霉素一Ds)物质：纯度999。3219标准储备溶液：分别准确称取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质(3217)(精确到01 rag)，用乙腈配成500 pgmL的标准储备溶液(4避光保存可使用6个月)。3220氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液：分别准确移取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉
14、素标准储备溶液(3219)，用乙腈稀释成50 pgmL的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液(4避光保存可使用3个月)。3221氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉索混合标准工作溶液：分别准确移取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液(3220)，用流动相稀释成合适的混合标准工作溶液(现用现配)。3222氯霉素氘代内标(氯霉素一D5)储备溶液：准确称取适量的氯霉素一D5标准物质(3218)(精确到01 mg)，用乙腈配成i00 pgmL的标准储备溶液(4避光保存可使用12个月)。3223氯霉素氘代内标(氯霉素一D5)中间溶液：准确移取适量的氯霉素一D5储备溶液(3222)，用乙GBT 223
15、38-2008腈配成i pgmL内标中间溶液(4避光保存可使用6个月)。3224氯霉素氘代内标(氯霉素一D。)工作溶液：准确移取适量的氯霉素一D。中间溶液(3223)，用乙腈配成01 p-gmL内标工作溶液(4避光保存可使用2周)。3225 LC-Si固相萃取柱或相当者：200 mg，3 mL。3226 EN固相萃取柱或相当者：200 mg，3 mL。3227一次性注射式滤器：配有045 pm微孔滤膜。33仪器和设备331液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。332高速组织捣碎机。333均质器。334旋转蒸发仪。335分析天平。336移液枪：200 gL、1 mL。337心形瓶：100 mL
16、，棕色。338分液漏斗：200 mL。339聚四氟乙烯离心管：50 mL。3310离心机。3311涡旋混合器。3312固相萃取装置。34试样制备与保存341试样的制备从原始样品中取出部分有代表性样品，经高速组织捣碎机均匀捣碎或混匀，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装人清洁容器内，加封后作出标记，一份作为试样，份作为留样。342试样的保存试样应在-20条件下保存。35测定步骤351提取3511动物组织(肝、肾除外)与水产品称取试样5 g(精确至001 g)，置于50 mL离心管中，加入100 pL氯霉素氘代内标(氯霉素一Ds)工作溶液(3224)和30 mL乙腈，匀浆，离心5 rain。将上
17、清液移人250 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈饱和的正己烷(32i1)，振荡5 rain，静置分层，转移乙腈层至100 mL棕色心形瓶中。残渣中再加入30 mL乙腈，振摇3 rain，离心5 rain，取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5 min，静置分层，转移乙腈层至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5 mL正丙醇，于40水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加5 mL丙酮一正己烷(3212)溶解残渣。3512动物肝、肾组织称取试样5 g(精确至0Ol g)，置于50 mL离心管中，加入30 mL乙酸钠缓冲液(3215)，均质2 min，加入300 pL p葡萄糖醛酸苷酶(32Io)，于37温育过夜
18、。消解样品中加入100 pL氯霉素氘代内标(氯霉素一D5)工作溶液(3224)，20 mL乙酸乙酯一乙醚(3214)，振摇2 min，离心5 rain。取上层有机层人心形瓶中，在40水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加5 mL丙酮一正己烷(3212)溶解残渣。3513蜂蜜称取蜂蜜试样5 g(精确至0Ol g)，置于50 mL离心管中，加入100 pL氯霉素氘代内标(氯霉素一D5)工作溶液(3224)，5 mL水，混匀，再加入20 mL乙酸乙酯，振摇2 rain，离心5 rain，移取有机层到5GBT 22338-2008100 mL棕色心形瓶中，于离心管中再加入20 mL乙酸乙酯，振摇2 min
19、，离心5 min，合并有机层于棕色心形瓶中，40水浴中旋转蒸发至干，3 mL水溶解残渣，混匀。352净化3521动物组织与水产品用5 mL丙酮一正己烷(3212)淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将残渣溶解溶液(3511、3512)转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5mL丙酮一正己烷(3213)洗脱，收集洗脱液于心形瓶中，40水浴中旋转蒸发至近干，氮气吹干，用1 mL水定容，定容液过045 pm滤膜(3227)至进样瓶，待测定。3522蜂蜜分别用5 mL甲醇，5 mL水活化EN固相萃取柱，将提取液(3513)转移上柱，用5 mL水淋涤，用玻璃棒压干1min，用3mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液用氮
20、气吹干，用1mL水定容，定容液通过045zm滤膜(3227)至进样瓶，待测定。353液相色谱一质谱质谱测定3531液相色谱条件a)色谱柱：Zorbax SBC185 pm，21 mm150 mm，或与之相当者b)流动相：水一乙腈一10 mmolL乙酸铵溶液，梯度洗脱程序参见表2表2梯度洗脱程序时间min 水 乙腈 10 mmolL乙酸铵溶液000 70 25 5200 25 70 5300 25 70 5800 70 25 5c)流速：06 mLmin；d)进样量：20 pL；e)柱温：40。3532质谱质谱条件参见附录C。3533定性测定按照上述条件测定样品和建立标准工作曲线，如果样品中化合
21、物质量色谱峰的保留时间与标准溶液的保留时间相比在允许偏差士25之内；待测化合物定性离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于3(sN3)，定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于10(sNlo)；定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准溶液相比，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在相应的目标化合物。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合标准工作溶液的液相色谱一质谱质谱多反应监测(MRM)总离子流图和重构离子色谱图以及各目标化合物相对保留时间参见附录D中图D1图D5和表D1。表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 50 2050 1020 10允许的相对偏差 士20 土25 士30
22、 士503534定量测定氯霉素使用内标法定量；甲砜霉素和氟甲砜霉素使用外标法定量。36结果计算试样中目标化合物残留量使用仪器数据处理系统或氯霉素残留量按式(2)计算，甲砜霉素和氟甲砜6霉素按式(3)计算GBT 22338-2008x一等鼍A嬲A W巡1 000(2)一 c。 。 。 一、 。x一瓮等獬 式中：x试样中待测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c标准工作溶液的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；c。标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；“样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A。标准工作溶液的峰面积；A样液中待测目标物的峰面积；A，标准工作溶液
23、中内标物的峰面积；A样液中内标物的峰面积；y试样定容体积，单位为毫升(mL)；w样品称样量，单位为克(g)。注：计算结果应扣除空白值。37测定低限液相色谱一质谱质谱法对氯霉素测定低限为01 pgkg；甲砜霉素和氟甲砜霉素为038回收率和精密度参见附录E。GBT 22338-2008附录A(资料性附录)氯霉素类标准物质衍生物的气相色谱-质谱总离子流色谱图和质谱图CAP1176墨警l一 1256 I 13TA59P8 61150 1200 12 50 1300 1350 1400train图A1 氯霉素类标准物质衍生物的总离子流色谱图02弋一?一s U”ccH归一”NHCOCHCl20筚36置鹃凹
24、甄j96“j16244j243争4硝524印472480a)间硝基氯霉素衍生物质谱图 一?一slh幽。H一百唧二，鹅皿娜8J。叫一一CH 20-一376j304p13辨222j23530印3印B8；蓝“1i424424414? 1分8以 310 330 350 370 390 410 430 450 470 mz250 270 290 310 330 350 370 390 410 430 mzc)氟甲砜霉素衍生物质谱图b)氯霉素衍生物质谱图d)甲砜霉素衍生物质谱图图A2 氯霉素类药物衍生物结构式和质谱图ml0钏上一鼍点。弘滤附录B(资料性附录)氯霉素类药物在不同基质中的平均回收率和精密度(G
25、CMS法)表B1 氯霉素类药物在不同基质中的平均回收率和精密度GBT 22338-2008添加浓度 水产品 畜禽肉 畜禽剐产品药物名称(，ugkg) 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD01 88I 98 802 89 800 100氯霉素 i0 864 55 854 57 887 7220 981 12 905 15 942 2105 989 129 101 146 109 154氟甲砜霉素 10 105 104 928 113 102 12220 880 151 853 101 899 10705 111 88 980 89 110 105甲砜霉素 10 94O 83 931 7
26、9 100 8820 936 77 895 65 903 69GBT 22338-2008附录c(资料性附录)液相色谱一质谱质谱测定参考条件”液相色谱一质谱质谱测定参考条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：负离子扫描；c)检测方式：多重反应监测(MRM)；d)电喷雾电压：一4 500 V；e)雾化气压力：0276 MPa；f)气帘气压力：0172 MPa；g)辅助气流速：0206 MPa；h)离子源温度：550；i)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压，见表C1。表c1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压定性离子对(mz) 定量离子对(mz
27、)药物名称 碰撞气能量eV 去簇电压v(母离子子离子) (母离子子离子)32091519 25 72氯霉素 3209151932092569 16 7335392899 18 75甲砜霉素3539289935391849 28 7535603360 一15 67氟甲砜霉素 35603360356O1849 27 6732611570 25 60氯霉紊一珏 3261157032612620 17 60101)非商业性声明：附录A所列参数是在APl4000串联质谱仪上完成的，此处列出的实验用型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器。GBT 22338-2008
28、附录D(资料性附录)氯霉素类标准物质的液相色谱质谱质谱总离子流色谱图和重构离子色谱图tmin图D1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准品总离子流色谱图图D2氯霉素重构离子色谱图|s口。吾H*E。Iu一40古H苦HGBT 22338-2008图D3 甲砜霉素重构离子色谱图25 3o 35 4o 45 5 o 5 5 6o 65 7o 7 5tmin图D4氟甲砜霉素重构离子色谱图图D5氯霉素一D5重构离子色谱图98642。曹ma3cH鼍奇；Po量表D1 氯霉素类药物参考保留时间GBT 22338-2008药物名称 保留时间min氯霉素 392甲砜霉素 172氟甲砜霉素 32813GBT 22338-
29、2008附录E(资料性跗录)氯霉素类药物在不同基质中的平均回收率和精密度(LC-MSMS法)表E。1添加浓度 动物肝、肾 畜禽肉与水产品 蜂 蜜药物名称(#gkg) 回收率范围 RSD 回收率范围“ RSD 回收率范围 RSDo1 8051070 115 8801091 135 8051018 110氯霉素 10 844980 51 9281086 8，8 8111074 13550 8911056 53 807977 92 9021080 8101 703962 83 680993 104 779941 92甲砜霉素 10 789920 3? 642947 109 797996 9150 757944 81 740899 53 8601003 4901 652-980 9，4 670-878 126 818-995 7S氟甲砜霉素 10 721896 62 701892 99 850-977 5450 703968 68 733930 71 79，6883 6014
