1、ICS 11220B 41 雪雪中华人民共和国国家标准GBT 229 1 02008200812-31发布痒病诊断技术Diagnostic techniques for scrapie2009-05-0 1实施宰瞀徽紫黼警塞攀瞥星发布中国国家标准化管理委员会况111刖 肓GBT 229 1 02008本标准是参照OIE(国际动物卫生法典)(2000年版)及诊断试验和疫苗标准手册)(2000年版)，以及美国农业部动物病研究所和瑞士的OIE传染性海绵状脑病参考实验室的有关规程和技术资料，结合我国农业部动物检疫所的验证试验结果编制而成。本标准的附录A、附录B、附录c为规范性附录。本标准由中华人民共和
2、国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：王志亮、刘雨田、吴镒三、吴晓东、于建敏、邹艳丽、王树双。痒病诊断技术1范围本标准规定了痒病临床诊断和实验室诊断的技术要求。本标准适用于绵羊和山羊的痒病诊断。2临床诊断GBT 229 1 02008痒病临床症状各种各样，病程短则几周，长则1年以上，终归死亡。患病母羊可发生流产。少数病例取急性经过，症状轻微，发病数日后突然死亡。病羊死后内脏常无肉眼可见的病变。当病羊出现以下全部或部分症状而又不能确定为其他疾病时，应怀疑痒病的可能：行为异常病初症状不易觉察，表现
3、为耐力下降，然后步态不稳并逐渐加重。时常欲饮水却饮得很少。此外，表现为焦躁不安、恐惧、精神错乱；呈攻击性或离群独处，呆立一旁，或摇头竖耳、凝视，或高抬腿跑步。初显症状3至4个月后，患羊感染加重而迸一步消瘦，行为异常逐渐加剧。瘙痒瘙痒是痒病的重要临床症状。表现为头顶、臀部和尾部开始擦痒，甚至强烈摩擦，啃咬或用后蹄搔抓身体痒感处，致使头顶、颜面、耳部、躯干体表和四肢皮肤脱毛、破损甚至撕脱。尤其胸部、胁部和后肢被毛广泛脱落。人为摩擦病羊尻部脊梁可诱导啃咬反应，或反射性伸颈摇头，咬唇和舌头运动。一感觉或反应过敏患羊反应过敏，对声音敏感，易受惊。有的病例的随意肌，特别是头、颈、胁腹和殷部，呈现肌肉震颤，
4、因人接近而兴奋使震颤加重，安静时则震颤变轻。一运动失调运动失调首先表现在转弯僵硬，后肢落地困难。随后，病羊蹒跚或倒地不起。体重和体况患羊的体重和体况明显下降，并随着病程的发展而进一步恶化，最后消瘦而死亡。3实验室诊断31组织病理学检查311采样临床症状可疑的痒病病羊经注射麻醉药物致死后，按剖检术式取出全脑，包括大脑和完整脑干。312固定将全脑和脑干直接放人10倍20倍脑体积的10中性福尔马林溶液中渗透固定5 d，换液后再维持一周。固定液配法见附录A。313组织切片制作3131组织切块把脑组织横切3 mm5 mm厚的组织块，选取以下部位组织作进一步处理：脑闩尾侧处延髓(闭合部与开张部)，脑干的桥
5、脑、中脑、丘脑及大脑纹状体，以上5块供检测用，保存其他部位备用。先切延髓，再切脑干。用新配制的固定液再固定一周，其间更换固定液3次。3132甲酸处理组织块将固定的组织块放人流水中漂洗24 h后，移入9598甲酸中作用2 h，水洗2遍，每遍10rain，1GBT 22910一2008然后再移人新配制的福尔马林溶液中保存至少24 h。3133脱甲醛将组织块放人流水中漂洗24 h以上。3134脱水依次在以下梯度酒精中分别脱水：a)75酒精中3 h；b)85酒精中3 h；c)95酒精I中3 h；d)95酒精中3 h；e)100“酒精I中3 h；f)100酒精中2 h。313，5透明依次在以下试剂中透明
6、：a)二甲苯I中20rain；b)二甲苯中20 rain。3136浸蜡依次在以下试剂中浸蜡：a)软蜡40 rain；b)硬蜡I(熔点5758)1 h；c)硬蜡(熔点5758)i h。3137包埋将浸过蜡的组织块放入包埋框内用熔化的新硬蜡(熔点5758)包埋，切面朝下放平。放冷后过夜修切成形。3138切片将石蜡组织块切成5 pm厚的组织薄片。每块组织连续切片3 j牛lo片，切片碎屑和废弃组织经134138高压蒸汽消毒15 min方能废弃或者直接焚烧处理。组织薄片用干净的粘附剂预处理过的载玻片贴片，也可用特殊处理的进13玻片贴片。3 139烤片贴好组织薄片的载玻片先在自然条件下晾干，然后放人455
7、0的恒温箱或烤箱中烘干4 h以上。31310脱蜡和脱二甲苯依次在二甲苯和梯度酒精中脱蜡去二甲苯：a)二甲苯110 rain；b)二甲苯10 rain；c)100酒精I 2 rain；d)100酒精2 min；e)95酒精I 2 rain；f)95酒精2 rain；g)85酒精2 rain；h)75酒精2 rain；i)自来水洗2 rain。314苏木素(HE)染色有关试剂配制见附录B。?GBT 229 1 02008依次按以下程序染色：a)苏木素染液15 min；b)自来水漂洗2rain；c)1盐酸酒精10 s；d)自来水漂洗5 rain；e)饱和碳酸锂水溶液30 s；f)自来水漂洗10min
8、；g)75酒精2 min；h)85酒精2 min；i)95酒精伊红液1 rain。315脱水、透明依次处理的程序如下：a)95酒精2min；b)100酒精I 2 min；c)100酒精2 min；d)二甲苯I 2 min；e)二甲苯2 min。316封片以适量中性树胶封片，置38温箱干燥或自然干燥。317贴签用适当大小的不干胶签贴在载玻片的磨砂端，然后用铅笔或记号笔将切片的编号、名称、实验时间等记录在不干胶签上。318镜检及判定3181镜检观察在光学显微镜下观察切片，倍数分别为1010、1020和1040。3182阳性结果灰质区神经细胞或神经纤维网浆中出现空泡变性。神经细胞内呈规则的圆形或卵圆
9、形，空泡内不着色或被伊红淡染，界限明显，胞核被挤压于一侧，甚至消失；有的神经细胞被单个或多个特异性空泡胀大，成为“气球样”空泡性神经细胞。特别容易出现病变的部位有延髓的迷走神经背核、舌下神经核、橄榄核、网状结构，桥脑的桥核、网状结构，中脑的红核、被盖核和丘脑内诸核等处。这些部位的神经细胞出现特异的大空泡以及丘脑、大脑纹状体空泡病变，且呈双侧对称性分布。在正常情况下，动眼神经核和红核处也可能有少量空泡出现，但不呈双侧对称，应注意区别。3183阴性结果灰质区无特征性空泡变性。3184确诊组织病理学检查只是痒病确诊的辅助方法，进行确诊时还应结合免疫组织化学方法或其他免疫学方法来进一步诊断。32免疫组
10、织化学法检查321试剂配制见附录c。322采样3221脑组织采样同311。3222活体采集第三眼睑淋巴组织的方法如下：在被检羊眼角滴加2盐酸利多卡因局部麻醉后，3GBT 229102008用消毒的眼科器械翻转并固定第三眼睑，采集粘膜表层淋巴组织。323固定将剖检取出的全脑或活体采集的淋巴组织，直接放人10倍20倍组织体积的lo中性福尔马林溶液中渗透固定5 d，换液后再维持一周。固定液配法见附录A。324操作方法3241 每次免疫组织化学检查，都要设置阳性和阴性痒病组织切片作为免疫组织化学检测对照用。3242组织切片制作法同313。3243自水中取出经脱蜡、去二甲苯的切片，在磷酸盐缓冲液(PBS
11、)中洗3次，每次5 rain。3244甲酸(98)作用5 rain，然后在PBS中洗3次，每次2 rain(系处理高度感染组织特别需要的)。3245将蛋白酶缓冲液水浴加温至37，按5 ttgmL加入蛋白酶K，立即放入切片确保切片全部浸入，消化15 min。3246在一个不锈钢饭盒中倒入刚煮沸的蒸馏水，并立即将切片放入盒中确保切片完全浸入水中，盖好盒盖，在121高压(约103 kPa)处理20 min，自然冷却至60以下取出。3247在PBS中洗3次，每次5 rain。3248将切片完全浸入3双氧水甲醇溶液中室温处理5 rain。3249在PBS中洗3次，每次5 rain。32410在切片的组织
12、上滴满5正常猪血清，置湿盒中室温作用20 min。32411弃去正常猪血清，用吸水纸吸干组织切片四周的液体。32412将抗PrP“核心片段单克隆抗体(有商品)稀释为5 ttgmL，滴加在组织切片上，确保组织完全覆盖，湿盒中37作用4 h，或者在28下作用过夜。32413在PBS中洗3次，每次5min。32414洗完后用吸水纸吸干组织切片四周的液体，然后在组织切片上滴加适量工作浓度的生物素标记的抗鼠抗体(有商品)，确保绲织完全覆盖，湿盒中室温作用10 min。32415在PBS中洗3次，每次5 min。32416洗完后用吸水纸吸干组织切片四周的液体，然后在组织切片上滴加适量工作浓度的亲和素辣根过
13、氧化物酶结合物(有商品)，确保组织完全覆盖，湿盒中室温作用10 min。32417在PBS中洗3次，每次5min。32418在蒸馏水中放置2 min。32419洗完后用吸水纸吸于组织切片四周的液体，然后在组织切片上滴加适量工作浓度的AEC(3氨基一9一乙基咔唑)底物显色液(有商品)，确保组织完全覆盖，湿盒中室温作用5 min10 rain。32420用Mayer氏苏木素液复染脑组织1 rain，淋巴组织30 S。32421在蒸馏水中放置2 min。32422专用封片剂封片。325结果判定在光学显微镜下(倍数为1010、1020和lo40)观察切片，结果判定如下：a) 阳性结果：在阳性和阴性对照
14、片染色结果正确的条件下，若组织切片灰质区(特别是脑门部的迷走神经背核、孤束核等处)或淋巴组织的生化中心出现特异性铁锈红色染色颗粒，则将该样品判为痒病阳性；b) 阴性结果：若组织切片灰质区(特别是脑门部的迷走神经背核、孤束核等处)或淋巴组织的生化中心未见特异性铁锈红色染色颗粒，则将该样品判为痒病阴性。附录A(规范性附录)10中性福尔马林固定液的配制10中性福尔马林固定液的配制氯化钠85 g蒸馏水 900mL40甲醛 100mL把以上材料混匀溶解即可使用。GBT 229 1 02008GBT 229 1 02008附录B(规范性附录)组织病理学检查(HE染色)试剂配制B1苏木素染色液B11 配方苏
15、木精 10 g无水乙醇 lomL蒸馏水 200mL氧化汞05 g冰乙酸 8 mL钾明矾 200 gB12配法先将苏木精溶于无水乙醇，然后将钾明矾和蒸馏水煮沸溶化，去火并迅速加入苏木精无水乙醇溶液中，立即加入氧化汞并煮沸，迅速冷却后加入冰乙酸，过滤后使用。B2 1盐酸酒精在100 mL的70或80酒精中加入05 mL或1 mL的浓盐酸。B3碳酸锂饱和水溶液在100 mL的70或80酒精中加入05 mL或1 mL的浓盐酸。B4碳酸锂饱和水溶液碳酸锂2 g加100 mL蒸馏水，充分溶解。B5 95酒精伊红溶液伊红05 g加入100 mL 95酒精中溶化。C1蛋白酶K缓冲溶液C11配方TrisHCl(
16、1 molL，pH8O)CaClz(O1 toolL)加蒸馏水至C12配法附录c(规范性附录)免疫组织化学检查的试剂配制25 mL075mL50 mL用前加蛋白酶K(147 mgmL)17 pL使终浓度达5 tzgmL。C2 3双氧水一甲醇(使用前5 min配制)甲醇 50 mLH20z(30) 15 mI，c3 1001 molL PBS(pH74)NaCl 80 gKCI 2 gNa2HP04 144 gKH2P04 24 g加水800 mI，溶解，调pH到74，加水至1 L。使用时作10倍稀释。C4 5正常猪血清(NSS)01 molL PBS(pH74)NSS4 mL200 btLGBT 229 1 02008C5 Mayer氏苏木素液C51配方苏木精 l g钾明矾 50 g碘酸钠02 g水合氯醛 50 g枸椽酸 1 g蒸馏水 1 000 mLC52配法将苏木精、钾明矾及碘酸钠依次加入水中，略加热并搅拌，待全部溶解后过夜。再加入水合氯醛及枸椽酸并加热煮沸5 min。冷却后过滤备用。如不急用可以不煮沸而在室温下待其成熟后使用，染液可以贮存较长时间。
