1、ICS 11220B 41 酉中华人民共和国国家标准GBT 229 1 72008猪水泡病病毒荧光RTPCR检测方法Protocol of fluorogenlc RTPCR for swine vesicular disease virus2008-12-31发布 2009050 1实施车瞀鹊鬻瓣警雠瞥星发布中国国家标准化管理委员会“”月U 置GBT 229172008本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)(第5版)。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中华人
2、民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：花群义、卢体康、吕建强、阮周曦、杨云庆、周晓黎、杨素、董俊、陈书琨。1范围猪水泡病病毒荧光RTPCR检测方法本标准规定了猪水泡病病毒荧光RT PCR检测的操作方法。本标准适用于动物及其产品中猪水泡病病毒的检测。2缩略语下列缩略语适用于本标准。21荧光RT-PCR荧光反转录聚合酶链反应。22 o值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。23 RNA核糖核酸。24 DEPC焦碳酸磷酯。25 PBS磷酸盐缓冲盐水，配方见附录A。26 Taq酶TaqDNA聚合酶。27 SVDV猪水泡病病毒。3原理GBT
3、229 1 72008根据猪水泡病病毒的基因特定序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。引物和探针通过严格的设计和筛选，涵盖已报道的所有猪水泡病病毒的毒株。荧光探针的5 r端标记FAM荧光素，3端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5端报告荧光基团发出的荧光信号。扩增时，由于Taq酶的5 r一3的外切活性，在延伸到荧光探针时，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。4材料与试剂41仪器与器材411荧光RTPCR检测仪。412高速台式冷冻离心机(离心速度12 000 rmin以上)。413台式离心机或手掌式离心机(离心速度
4、3 000 rrain)。414混匀器。415冰箱(28和一20两种)。416微量可调移液器(5 pL，10 pL，100 pL，1 000 pL)及配套带滤芯吸头。417 15 mL、05 mL硅化Eppendorf管：将Eppendorf管和滴头浸泡于含有01DEPC的三蒸水中过夜，121士2高压灭菌15 min，40烘干备用。市售Eppendorf管和滴头已经硅化，可直接1GBT 229 172008使用。418 02mL透明薄壁PCR管。419 66孔或58孔冰盒。4110水浴锅：0100。4111旋涡振荡器。42试剂421本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用
5、DEPC水处理后高压灭菌)分装。422三氯甲烷。423异丙醇：一20预冷。424 PBS：配制方法见附录A。425 75乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20预冷。426裂解液：配制方法见附录A。427酚(分析纯)。428无水乙醇(分析纯)。429 AMV反转录酶(5 UuL)：-20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4210 dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP备10 mmoLL。4211 RNA酶抑制剂(RNasin，40 UvL)：一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4212 Taq DNA聚合酶(5 UpL)：一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。421
6、3反转录和PCR缓冲液(5)：配制方法见附录A。4214氯化镁(25 retoolL)。4215 引物(15zmolL)：上游引物5一GGcAAcGcATACAGcATGTT一3；下游引物5-GCCGTATGTCCCTTGCTTGT一3。4216荧光双标记探针(10#toolL)：(FAM)5LTATGACGGGTGGGCCAGGTT一3 7(TAMRA)，42 17 DEPC处理水：按01加入DEPC，摇匀，室温静置过夜，1212高压灭菌20min，冷却备用。5抽样51采样工具511下列采样工具应经1212，15min高压灭菌并烘干。512棉拭子。513剪刀、镊子。514注射器。515 15
7、mL Eppendorf管。516研钵。517真空采血管。518记号笔。519低温保藏箱或冰盒。52样品采集521 采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织、水泡液、血液、口腔分泌物和组织。采集后立即冷藏送检或置于含抗生素的PBS缓冲液中4环境下保藏。编号并作好记录。522水泡液及水泡皮：只有当水泡完整时才能采集到水泡液，用75酒精轻轻消毒水泡表皮，尽量去掉污物，用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓ZGBT 229172008冲液灭菌瓶中。水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放入含抗生素的PBS缓冲液中。523口腔分泌物和咽喉拭子：用拭子采取口腔
8、分泌物或将拭子深人口腔内来回刮3次5次取分泌液，拭子一并放人盛有10mL含抗生素的PBS缓冲液的15mL Eppendorf管中。也可用食道探杯刮取咽喉液体，放人加有抗生素的PBS中。编号，冷藏送检或低温保藏。524血液：用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌Eppendorf管中，密封、编号后保存于4环境中送检。525肌肉或组织脏器：无菌采集待检样品，装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，冷藏送检或低温保藏。53样品贮运样品采集后，放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放人一个塑料袋内)，于保温箱中加冰、密封，送实验室。54样品制备541 水泡液、血液和口腔分泌物样品在混匀器上充分混合后，用
9、高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 min，取上清液转入无菌的15 mL Eppendorf管中，编号备用。542水泡皮、肌肉或组织脏器取待检样品20 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10 n1L PBS混匀，4下以3 000 rrain离心15 rain，取上清液转入无菌的15 mL Eppendorf管中，编号备用。55样本存放制备的样本在28条件下保存应不超过24 h，若需长期保存应置一70以下，但应避免反复冻融(冻融不超过三次)。6操作方法61实验室要求猪水泡病病毒荧光RTPCR检测的实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混合物配制区和检测区；各工作区域应
10、有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用；每一区域应有专用的仪器设备；进入各个工作区域应严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配制区至检测区。62样本的处理621在样本制备区进行。样品中总RNA提取的试剂盒，有商品化试剂盒出售，也可自行配制。622取n个灭菌的15 mL Eppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和，编号。623每管加入600 pL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200 pL，一份样本换用一个吸头，再加入200 pL三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5 s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4以12 0
11、00 rmin离心15 min。624取与622相同数量灭菌的15 mL Eppendorf管，加入500 pL异丙醇(一20预冷)，做标记。吸取623各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500 FL，不能吸出中间层，颠倒混匀。625于4、以12 000 rrain离心15 min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600 FL 75乙醇，颠倒洗涤。626 于4、以12 000 rmin离心10 min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上
12、，尽量沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。GBT 229172008627以4 000 rrain离心10 s(Eppendor管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3rain，不能过于干燥，以免RNA不溶。628各管加入ll pL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以2 000 rmin离心5 S，冰上保存备用。提取的RNA应在2 h内进行PCR扩增；若需长期保存应放置于一70冰箱内。63检测631 荧光RT-PCR反应液的配制在反应混合物配制区进行。设所需荧
13、光RT-PCR检测总数为n(n一“+2+1)，其中“为被检样品数、2为阳性对照数、1为阴性对照数，按表1配制反应体系混合液。配制在冰盒中进行。表1 反应体系混合液配制序号 组 分 每管用量“L n管总用量几L1 AMV反转录酶(5 U弘L) 1 n12 dNTPs(每种均为10 retoolL) 5 n53 RNasin(40 UuL) 1 n14 raq DNA聚合酶(5 UpL) 05 055 反转录和PCR缓冲液(5) 10 nXl06 氯化镁(25 mmolI) 6 w67 上游引物(1 5amolL) l n18 下游引物(15 pmolL) 1 nXl9 探针(10JmolL) 1
14、 nI10 DEPC水 135 n13 5632荧光RT-PCR反应液分装将631中配制的荧光RT-PCR反应液充分混合均匀，按每管40 pL分装于02 mL透明PCR管，将PCR管放于96孔板上，一定要按顺序记录好被检样品管、阳性对照管、阴性对照管。转移至样本处理区。633加样在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入628中制备的RNA溶液10 pL，盖紧管盖，以500 rmin离心30 S。转移至检测区。634荧光RT-PCR检测6341在检测区进行。将733中离心后的PCR管放人荧光RT PCR检测仪内，在96孔板内(表内)记录或填写被检样品(Unknown)、阳性对照(Pc)、阴
15、性对照(NTc)。设置探针：5为FAM，3为TAMAR。6342循环条件设置：第一阶段，反转录42130 min；第二阶段，预变性943 min；第三阶段，9420 S，6030 S，40个循环。试验检测结束后，保存结果，根据收集的荧光曲线和c值判定结果。7结果判定71 结果分析和条件设定直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴4GBT 229 172008性样品扩增曲线的最高点为准。72质控标准721 阴性对照无。值，并且无扩增曲线，一直为水平线。722阳性对照的。值应小于30o，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合。否则，此次实验视
16、为无效。73结果描述及判定731阴性无c值并且无扩增曲线，表示样品中无猪水泡病病毒。732阳性Q值小于等于300，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在猪水泡病病毒。733有效原则cf值在30o380的样本建议重做。重做结果无c值或者大于300为阴性，否则为阳性。GBT 229172008A1磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制附录A(规范性附录)试剂的配制A11 A液02 molL磷酸二氢钠水溶液：磷酸二氢钠(NaHzPOtHz0)276 g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1 000 mL。A12 B液02 molL磷酸氢二钠水溶液：磷酸氢二钠(Na2HP047Hzo)536 g(或Na2HP0412Hz
17、O716 g，或Na：HPO。2H。O 356 g)，加蒸馏水溶解，最后稀释至1 000 mL。A13 001 molL、pH72磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制取A液14 mL，B液36 mL，加氯化钠(NaCl)85 g，用蒸馏水稀释至l 000 mL。经121215 min高压灭菌，冷却后，无菌条件下按每毫升加人1 000 IU青霉素、1 000 pg链霉素。A2裂解液裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4保存；可直接购买商品化的Trizol试剂。A3反转录和PCR缓冲液(5)配制A31 TrisHCl：250 mmolL，pH83。A32氯化钾：250 mmolL。A33氯化镁：50 mmolL。A34 DTT：50 mmo|L。A35 TritonX_100：1。6
