1、ICS 67050X 04 酉雪中华人民共和国国家标准GBT 22947-2008蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of 1 8 sulfonamides residues in royal jellyLCMSMS method2008-12-31发布 2009-05-01实施丰瞀徽紫瓣警矬瞥霎发布中国国家标准化管理委员会况19月U 吾本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：贾光群、曹彦忠、张进杰、王占英、石玉秋、姚智慧、庞国芳。GB
2、T 22947-2008蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22947-20081范围本标准规定了蜂王浆中十八种磺胺类药物(见表2)残留量液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定。本标准的方法检出限均为50 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注13期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注13期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(
3、正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 5725-1：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792-2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理蜂王浆中磺胺类药物残留用去离子水提取，三氯乙酸沉淀蛋白，离心后，上清液经Oasis MCX离子交换柱”或相当的同相萃取柱净化，用氨水一甲醇溶液(1+19)洗脱并蒸干，残渣用乙腈一001 molL
4、乙酸铵溶液溶解，过02zm滤膜后，样品溶液供液相色谱串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44乙酸铵：优级纯。45三氯乙酸：优级纯。46甲酸：优级纯。47氨水：分析纯。48 0ol molL乙酸铵溶液：称取077 g乙酸铵(44)溶于1 000 mL水中。49 2甲酸溶液：吸取2mL甲酸(46)，用水稀释至100mL。410 50三氯乙酸溶液：称取20 g三氯乙酸(45)溶于20 mL水中。411氨水一甲醇溶液(1+19)：吸取5mL氨水(47)与95mL甲醇(42)混合均匀。412 乙腈一001 molL乙酸铵溶液(3+2
5、2)：量取12 mL乙腈(43)与88 mL乙酸铵溶液(48)混合均匀。1)0asis MCX离子交换柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1GBT 22947-2008413 十八种磺胺类药物标准物质：磺胺嘧啶(CAS：68359)、磺胺噻唑(CAS：7214一o)、磺胺吡啶(CAS：144832)、磺胺甲基嘧啶(CAS：127797)、磺胺间甲氧嘧啶(CAS：1220 83 3)、磺胺甲噻二唑(CAS：14482 I)、磺胺二甲嘧啶(CAS：5768 1)、磺胺甲氧哒嗪(CA
6、S：80353)、磺胺对甲氧嘧啶(CAS：651069)、磺胺氯哒嗪(CAS：8032一o)、磺胺甲基异嘿唑(CAS：723466)、磺胺邻二甲氧嘧啶(cAs：2447576)、磺胺二甲异嚼唑(CAS：127695)、磺胺苯酰(CAS：127719)、磺胺氯吡嗪(CAS：102658)、磺胺苯吡唑(CAS：526089)、磺胺间二甲氧嘧啶(CAS：1037509)、磺胺喹嘿啉(CAS：59405)。纯度99。414 01 mgmL标准储备溶液：准确称取适量的每种磺胺标准物质(413)，用甲醇分别配成01 mgmL的标准储备溶液。该溶液在4保存。415 50 pgmL磺胺混合标准工作溶液：分别吸
7、取各标准储备溶液(414)05 mL移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成50tgmL混合标准工作溶液。该溶液在4保存。416磺胺内标物质：磺胺甲基异嚼唑-D4、磺胺嘧啶一D4、磺胺噻唑一D4。纯度99。417 01 mgmL磺胺甲基异曙唑一D4、磺胺嘧啶一D4、磺胺噻唑一D4内标储备溶液：称取适量磺胺甲基异曙唑一D4、磺胺嘧啶一D4、磺胺噻唑D4标准物质(416)，用甲醇分别配成01 mgmL的内标储备溶液。该溶液在4保存。418混合内标工作溶液：分别吸取磺胺甲基异嘿唑一D4、磺胺嘧啶一D4、磺胺噻唑一D4储备溶液(417)各05mL移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液在4保存。41
8、9基质标准工作溶液：吸取不同体积标准工作溶液(415)和20 pL混合内标工作溶液(418)，用空白样品提取液配成50 ngmL、100 ngmL、200 ngmL、500 ngmL、1000 ngmL不同浓度的基质标准工作溶液。当天配制。420 OasisMCX柱或相当者：150mg，6mL。用前依次用5mL甲醇(42)和10mL水处理。保持柱体湿润。42滤膜：02“m。5仪器51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。52分析天平：感量01 mg和001 g。53具塞的聚丙烯试管：50 mL。54振荡器。55液体混匀器。56固相萃取装置。57玻璃贮液器：50 mL。58氮气浓缩仪。59浓缩
9、管：10 mL。6试样制备与保存61试样的制备对于冷冻的实验室样品，待其解冻后将其搅拌均匀。分出05 kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。62试样的保存将试样于一18冷冻保存。27测定步骤GBT 22947-200871提取称取2 g试样，精确至001 g。置于50 mL具塞的聚丙烯试管(53)中，加入20 pL内标工作溶液(418)，然后加入20 mL水，于液体混匀器(55)上快速混匀1 rain，再置于振荡器(54)上振荡提取10 min，加入05 mL三氯乙酸溶液(4IO)，快速摇动30 s，以3 000 rrain离心5 rain，移取上清液至三角瓶中，再向残渣中
10、加入15 mL水，重复上述步骤，合并上清液，待净化。72净化将塞有玻璃棉的玻璃贮液器(57)连到Oasis MCX柱(420)上，把上清液(71)倒人玻璃贮液器中，调节流速小于3mLmin，待样液完全流出后，依次用5mL甲酸溶液(49)和5mL甲醇(42)洗柱，弃去全部流出液。最后用5 mL氨水一甲醇溶液(411)洗脱，收集洗脱液于10 mL浓缩管(59)中。用氮气浓缩仪(58)于50吹干。准确加入10 mL乙腈一001 molL乙酸铵溶液(412)溶解残渣，样液过02 tLm滤膜后，供液相色谱一串联质谱仪测定。按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液。73测定条件73
11、1液相色谱参考条件a)色谱柱：Atlantis C1 8，3 pm，150 mm21 mm(内径)或相当者；b)流动相：A：乙腈，B：01甲酸水溶液，C：甲醇。梯度洗脱条件见表1；c)流速：02 mLmin；d)柱温：35；e) 进样量：20 pL。表1流动相梯度表时间rain A B C0 00 100 800 100300 200 700 10 0800 350 550 10012 00 700 200 10O12 0l 100 800 10017 00 100 800 100732质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d)电喷雾电压：5
12、 500 V；e)雾化气压力：0076 MPa；f)气帘气压力：0069 MPa；g)辅助气流速：6 Lmin；h)离子源温度：350；i)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表2。GBT 22947-2008表2十八种磺胺类药物的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压定性离子对 定量离子对 碰撞气能量 去簇电压化合物中文名称 化合物英文名称(mz) (mz) V V251156 23 55磺胺嘧啶suJfadiazine 25l156251185 27 50256156 22 55磺胺噻唑 suathlazole 256156256107 32 47250156 25 50磺
13、胺吡啶 sulfapyridine 2501 56250184 25 60265156 25 50磺胺甲基嘧啶 sulfamethoxypyridazine 265156265172 24 60281156 25 65磺胺问甲氧嘧啶 sulfamonomethoxine 281156281215 25 50271166 20 50磺胺甲噻二唑sulfamethizole 271156271107 32 50279156 22 55磺胺二甲嘧啶sulfamethaziae 279156279204 20 60281156 25 65磺胺甲氧哒嗪 sulfamethoxypyridazine 28
14、1156281215 25 50281156 25 65磺胺对甲氧嘧啶sulfameter 281156281215 25 5028556 23 50磺胺氯哒嗪 sulfachloropyfidazine 285156285108 35 50254156 23 50磺胺甲基异嚼唑 sulfamethoxazole 254156254147 22 45311156 31 70磺胺邻二甲氧嘧啶 sulfadoxine 31115631110835 55268156 20 45磺胺二甲异嚼唑 sulIisoxazole 26815626811323 45277156 20 85磺胺苯酰 sulfab
15、enzamide 277156277108 35 85285156 24 53磺胺氯吡嗪sulfachloropyrazine 285156285108 37 53315156 32 55磺胺苯吡唑 sulfaphenazole 31515631516035 55311156 31 70磺胺间二甲氧嘧啶sulfadimethoxine 311156311218 27 70301156 25 42磺胺喹嚼啉 sulfaquinoxaline 30115630l208 28 424GBT 22947-200874液相色谱一串联质谱测定741定性测定将各被测组分分别选择1个母离子，2个以上子离子，在
16、相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在土25之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示l 相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10I 允许最大偏差 士20 25 士30 士50742定量测定用基质标准工作溶液(419)分别进样，以各标准峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，以各标准工作溶液浓度与内标溶液浓度的比值为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中十八种磺胺
17、类药物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，十八种磺胺类药物的参考保留时间见表4。十八种磺胺类药物的标准多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。本方法中十八种磺胺类药物添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。表4十八种磺胺类药物参考保留时间化合物名称 保留时间rain 化合物名称 保留时间min磺胺嘧啶 4 45 磺胺氯哒嗪 891磺胺噻唑 477 磺胺甲基异唔唑 929磺胺吡啶 539 磺胺邻二甲氧嘧啶 929磺胺甲基嘧啶 620 磺胺二甲异唔唑 972磺胺间甲氧嘧啶 775 磺胺苯酰 1050磺胺甲噻二唑 776 磺胺氯吡嗪 10 85磺胺二
18、甲嘧啶 783 磺胺苯吡唑 11 11磺胺甲氧哒嗪 80l 磺胺问二甲氧嘧啶 11 12磺胺对甲氧嘧啶 875 磺胺喹瑶啉 1l 2275平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定结果按式(1)计算。x=Cs五AiCi鲁署揣式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(#gkg)；Cs基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)A试样溶液中被测物的色谱峰面积；A，基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；GBT 22947-2008ci试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL
19、)；“基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)A。基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A试样溶液中内标物的色谱峰面积；V样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，蜂王浆中十八种磺胺类药物添加浓度范围及重复性方程见表5。表5 添加浓度范围及重复性和再限性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范
20、围 重复性限r 再现性限R磺胺嘧啶 5o500 lg r一1319 5 lgm 1566 1 19 r一1_261 3lg m_11 287 2磺胺噻唑 50500 19 r一1428 1 19m 1757 3 IgRl 376 619m一1 335 7磺胺吡啶 50500 lgR0 933 7lgm1049 9 lg r一1 183 0lgm 0973 5磺胺甲基嘧啶 50500 IgRl 278 7lgnl 485 2 lgRl 205 0lg1 141 9磺胺间甲氧嘧啶 50500 lg r一1306 1 lgm 1625 2 19 r一1118 6lgm 1090 5磺胺甲噻二唑 50
21、500 lgRl 085119n1 426 9 lg r=L1 177 4lg m_11 162 7磺胺二甲嘧啶 50500 lg r一0958 2lgm一1185 0 19 r一1074 5lgm 1028 7磺胺甲氧哒嗪 50500 lg r一1 342 3lgm一1299 5 19 r一13141lgm 0966 3磺胺对甲氧嘧啶 50500 lgR0 892 0lgnl 016 0 lg0 987 5lg0 9051磺胺氯哒嗪 50-500 lffRl 415 4lg1 436 3 lg r一1390 0Igm一1180 3磺胺甲基异曝唑 5 050 0 Ig r一0 836 9lgm
22、 1 030 3 lg r=L1 096 6IgI 156 0磺胺邻二甲氧嘧啶 5050 0 Ig r一1099 1 lgm 1181 8 ig r一1085 7lgm 0 905 3磺胺二甲异嘿唑 5050 0 lg r=L1 147 0191 267 0 lg r一1468 6 lgm一1379 2磺胺苯酰 50500 lg r一1056 9 lgm 1277 6 lgRl 452 8lgm一1486 6磺胺氯吡嗪 50500 lg r一0844 9lgm 1120 8 IgR0 976 9 lgm一0821 8磺胺苯毗唑 50500 lg r一1181 3 lgm一1481 1 lg r
23、一1 363 0lgm一1370 7磺胺间二甲氧嘧啶 50500 lgt-=1047 7lgm一1323 2 lg，一1335 0lgm一1317 3磺胺喹嘿啉 50500 lg r一0918 5 lgm 1065 4 lgRl 352 2 lgm一1157 7注：m为两次测定值的平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，蜂王浆中十八种磺胺类药物添加浓度范围及再现性方程见表5。6附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图十八种磺胺类药物标准物质多反应监测(MRM)色谱图
24、见图A1。响3 oe4应值2 5e42oe4l&41 0e45 000 O盘。6e。值1 5。414e41 2c4l oc48 000 O6 000 04 000 02 000 0磺胺噻睦I磺胺嘧啶I75 q磺胺间甲氧嘧啶应崔磺胺二甲嘧啶t磺胺甲基异唯唑GBT 22947-2008磺胺吡啶L磺胺对甲氧嘧啶磺胺邻二甲氧嘧啶图A1 十八种磺胺类药物多反应监测(MRM)色谱图f而n，一I，。一一。珊下畦黻GBT 22947-2008lt磺胺二甲异瑶唑E磺胺苯毗唑8“da磺胺问二甲氧嘧啶图A1(续)嘶_一卜一嗪i一氟一4胺一一一鬻篇烹粼粼。响应值i。一恤Ilj。一科眦斛M科咐3322l1a响应值0附录
25、B(资料性附录)回 收 率本方法中十八种磺胺类药物添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B1。GBT 22947-2008表Bt 十八种磺胺类药物添加浓度及其平均回收率的试验数据化台物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率50 104 9100 109 6磺胺嘧啶200 990500 107050 995100 98 5磺胺噻唑200 95 8500 10805 0 928100 89 0磺胺吡啶200 94 4500 91350 82910 0 868磺胺甲基嘧啶20 0 84 8500 82550 92210 0 91 5磺胺间甲氧嘧啶200 930500 98250 95 4100 979
26、磺胺甲噻二唑20 0 96150 0 100250 974100 945磺胺二甲嘧啶200 941500 97450 95310 0 947磺胺甲氧哒嗪20 0 922500 929GBT 22947-2008表B1(续)化台物名称 舔加浓度(pgkg) 平均回收率50 944100 975磺胺对甲氧嘧啶200 981500 94950 96 S100 973磺胺氯哒嗪200 959500 110 550 105810 0 1091磺胺甲基异曙唑200 97950 0 112 65，0 865】00 93 4磺胺邻二甲氧嘧啶200 91650，0 9695，0 92110 0 889磺胺二甲异耀唑200 93 0500 9325，0 934100 9l 6磺胺苯酰200 94 8500 10255 0 910100 905磺胺氯吡嗪200 89 3500 96150 986100 867磺胺苯吡唑200 802500 84 45，0 1055100 1023磺胺问二甲氧嘧啶200 874500 82650 86 4100 83 4磺胺喹孵啉200 842500 85810
