1、ICS 67050X 04 a雷中华人民共和国国家标准GBT 229492008蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination nitroimidazole residues in royal jellyand lyophilized royal jelly farinaLCMSMS method2008-12-31发布 2009-05-01实施宰瞀鹳紫瓣警麟瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅111刖 昌GBT 22949-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归1：3。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出
2、入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人：殷居易、刘永明、谢东华、陈杰、李金、章再婷、范春林、裘定慧、庞国芳。1范围蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22949-2008本标准规定了蜂王浆及冻干粉中甲硝唑、地美硝唑、替硝唑、洛硝唑、特尼哒唑、异丙硝唑，以及羟基化甲硝唑、羟基化异丙硝唑、2一羟甲基一1一甲基化一5一硝咪唑等9种硝基咪唑类药物残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于蜂产品(蜂王浆、冻于粉及蜂蜜)中硝基咪唑类药物残留量的测定。本标准蜂王浆样品的方法检出限：05 pgkg。本标准冻于粉样品的方法裣出限：10 pgk
3、g。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第l部分：总则与定义(GBT 63791-2004，IS0 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，SO 57252：1994，ID，
4、r)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6882 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理本方法用乙酸钠缓冲液溶解样品基质，乙酸乙酯进行液一液萃取，经过旋转蒸干后，加入四氯化碳和含酸水溶液，离心后取上层溶液，运用液相色谱串联三重四极杆质谱仪(LC-MS-MS)进样检测。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41乙腈：色谱纯。42甲醇：色谱纯。43乙酸乙酯：色谱纯。44甲酸：色谱纯。45四氯化碳。46乙酸钠。47标准品：甲硝唑(metronidazole，缩写MNZ；CAS：443481)，地美硝唑(dimetridazol
5、e，缩写DMZ；CAS：551928)，替硝唑(tindazole，缩写TNZ；CAS：19387918)，洛硝唑(ronidazole，缩写RNZ；CAS：7681767)，特尼哒唑(ternidazole，缩写TerNDZ)，异丙硝唑(ipronidazole，缩写IPZ)，羟基化甲硝咪唑(metronidazole-OH，缩写MNZOH)，羟基化异丙硝唑(ipronidazole-OH，缩写IPZOH)，2-羟甲基一1一甲基化一5一硝眯唑(2-hydroxymethyl一1一methyl一5一nitroimidazole，缩写HMMNI)，以上标准物质纯度】GBT 22949-20089
6、8。内标物为氘代2一羟甲基一卜甲基化一5一硝眯唑(HMMNID3；CAS：8061527)，氘代羟基化异丙硝唑(IPZOHD3；CAS：8061527)，氘代物质纯度95。48标准储备溶液：1 000 pgmL。准确称取100mg士005mg各标准物质，用甲醇溶解于10mL棕色容量瓶中(可放置于超声波清洗器数分钟促进溶解)，定容后配成浓度为1 000 pgmL的标准储备液。将储备液置于一20冰箱中保存备用。49标准中间溶液：100 ngmL。可将标准储备溶液(48)室温下放置5 rain，使用时用乙腈稀释至所需浓度，临用临配。410乙酸钠缓冲溶液：01 molL。准确称取8204 g无水乙酸钠
7、，加入583 mL冰乙酸定容到1 000 mL容量瓶中，超声混合并脱气15 min后，于液相色谱流动相瓶中备用。411 甲酸水溶液：01。准确移取1 mL甲酸，用水定容到l 000 mL容量瓶中，超声混合并脱气15 min后，于液相色谱流动相瓶中备用。412基质混合标准工作液：根据标准物质的灵敏度和仪器线性范围，吸取一定量的中间浓度混合标准液(49)，用空白样品提取液配制成系列浓度的基质混合标准工作液。临用临配。413滤膜：02 pm。5仪器5I 液相色谱一串联三重四极杆质谱仪(LCMSMS)：质谱仪配有大气压化学电离源(或与之等效电离源)；高效液相色谱配有在线脱气机、低残留自动进样器、可控温
8、柱温箱和高精度混合泵。52电子分析天平：感量01 mg和10 mg。53冷冻离心机：速度可达4 000 rrain和13 000 rmin。54氮吹仪：水浴和加热控温。55台式分散仪。56旋转浓缩仪：带真空蒸发和循环冷却水。57超纯水器。58超声波清洗器。59多功能食品粉碎机。510旋涡混合仪。511鸡心瓶：125mL。512离心管：15 mL和50 mL；聚四氟乙烯材质。513容量瓶：10 mL和1 000 mL。6试样的制备与保存6I试样的制备将液体、浆状、粉状的样品充分混合均匀；将低温保存的固体样品进行粉碎磨细后供检测。必要时将实验室样品用四分法进行缩分。根据样品的性状和保存要求将样品保
9、存在适当的环境中避免变质。62试样的保存将试样于一20冰箱中保存备用。7测定步骤71提取称取约25 g50 g试样(蜂王浆称量50 gq-O2 g；冻干粉称量25 g-i-_o2 g)于50 mL离心管中，分别添加氘代标示物HMMNI-D3、IPZ_OHD3(47)100 pL，加入20mL乙酸钠缓冲溶液(410)充2GBT 22949-2008分涡旋振荡提取1 rain。再加入20 mL乙酸乙酯，经过涡旋、液一液萃取，将乙酸乙酯层全部移入鸡心旋蒸瓶，重复上述操作，合并三次乙酸乙酯提取液于鸡心旋蒸瓶，在40以下浓缩近干，除去溶剂。72净化鸡心旋蒸瓶残渣用1 mL四氯化碳和1 mL甲酸水溶液(4
10、11)溶解，充分涡旋1 rain。吸取上层水溶液，用微孔过滤膜(O2 pm)过滤，此为试验溶液。73色谱测定731液相色谱参考条件a)色谱柱：Waters Sunfire ODS C5 kcm，250 mmX46 mm(内径)或相当者；b)柱温：30；c)流动相：01甲酸水溶液；液相梯度见表l；d) 流速：800 p-Lmin；e)进样量：10 pL。表1液相色谱流动相梯度表时间rain 流动相A(甲酸水溶液) 流动相B(乙腈溶液) 流速(pLmin)000 95 5 800200 95 5 800600 65 35 8001200 10 90 8001400 10 90 8001500 95
11、 S 8002000 95 800732质谱参考条件a) 离子源：大气压化学电离源(或与之等效电离源)；b)扫描方式：正离子扫描；c) 检测方式：多反应离子监测(MRM)；d) 电喷雾电压(IS)：5 250 V；e)雾化气(NEB)相对开放流量：1400 mLmin；f) 气帘气(cuR)相对开放流量：700 mLmin；g)离子源温度(TEM)：500；h)碰撞池出口电压(cxP)：11 V；i) 选择离子驻留时间(Dwell)：50 ms；j) 碰撞池入口电压(EP)：100 V；k)碰撞气(CAD)相对开放流量：8 mLmln；1) 辅助气流压力：4138 kPa；m)去簇电压(DP)
12、：35 V；n)焦环聚焦电压(FP)：200 V；o) 喷雾器放电针电流(Nc)：2 pA；p)检测器参数(正离子化模式)，离子流转向电压(DF)：一2000 V；检测器脉冲信号增强电压(CEM)：2 3000 V；q)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量、色谱峰保留时间见表2。GBT 22949-2008表2硝基眯唑类药物中英文名称、定性离子对、定量离子对、碰撞气能量、色谱峰保留时间定性离子对 定量离子对 碰撞气能量 色谱峰保留化合物中文名称 化合物英文名称(mz) (mz) (CE)V 时间rainmetronldazole-OH 18801259 25羟基化甲硝睬唑 188O1259 90
13、1缩写：MNzf0H188O1440 20metronidazole 172 01280 22甲硝唑 1720128 o 948缩写：MNZ 17208210 352羟甲基一1一甲基 2-hydroxymethyl-1-methyl- 15801400 205-nitroimidazole 15801400 967化一5硝咪唑 1580551 33缩写；HMMNI氘代2一羟甲基一1一甲基D32 Hydroxymethyl一1一161O1431 24methyl-5一nitro-imidazole 161o1431 963化5硝眯唑161058o 32缩写：HMMNI口ternidazole 1
14、86o1281 24特尼哒唑 186O1281 990缩写：TerNDZ186o82，2 40洛硝唑 20101400】820101400 1021缩写：RNZ20101100 25dimetridazole 142096 1 25地美硝唑 142o961 1032缩写：DMZ 1420811 37tindazole 24801210 25替硝唑 248O1210 1106缩写：TNZ 2480931 28ipronidazole-OH 186O168 0 20羟基化异丙硝唑 186O168o 1140缩写：IPZ-OH 186o1221 28IYIpronidazole-OH 1890171
15、0 25氘代羟基化异丙硝唑1890171o 1140缩写：IPZ-OHD3 189o125o 35ioronidazole 17001241 2S异丙硝唑 17001241 12 79缩写：IPZ1700109 1 35733液相色谱一串联三重四极杆质谱测定7331定性测定被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物保留时间与标准溶液中保留时间偏差在土25之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判断为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度
16、K K50 20K50 10K20 K10允许的最大偏差 土20 士25 土30 土507332定量测定在仪器正常工作条件下，对基质混合标准工作溶液(412)进样，以标准溶液中被测组分峰面积为纵坐标，标准溶液中被测组分浓度为横坐标绘制工作瞳线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中4GBT 22949-2008待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，超过线性范围则应适当稀释后再进行分析。方法采用外标法定量。9种硝基眯唑类药物和2种氘代内标物的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A图A1。各分析物质的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中表B1和表B2。74平行试验按以上步骤。对同一试样
17、进行平行试验测定。75回收率试验阴性样品中添加标准溶液，按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算蜂王浆及冻干粉中甲硝唑、地美硝唑、替硝唑、洛硝唑、特尼哒唑、异丙硝唑，以及羟基化甲硝唑、羟基化异丙硝唑、2一羟甲基一1一甲基化一5一硝咪唑等9种硝基咪唑类药物残留量的测定结果按式(1)计算：x一会乏舍羔揣式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(pgkg)；屯基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A一一试样溶液中被测物的色谱峰面积；A。基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；ci-一试样溶液中内标物的浓度，单位纳克每毫升(ng,mL)；c。基质标准工作溶液中
18、内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A。一基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A试样溶液中内标物的色谱峰面积；y样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m一试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对值不超过重复性限r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表4和表5。表4 蜂王浆样品基质添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化舍物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现
19、性限R羟基化甲硝咪唑 05250 lgr=0957 0lgm一0817 6 gR=O711 5lg，lO582 9甲硝唑 05250 igr-1092 2Igm 0864 8 gR=0722 519in-0525 32羟甲基一1甲基化一5一硝咪唑 05250 lgr=0993 0lgm一0774 2 lgR=0644 419m一0 547 1特尼哒唑 05250 lgr=0906 7lgm 0698 9 lgR=0 661 9Igm一0503 9洛硝唑 05250 gr=0981 4lgm一0768 2 lgR=0600 1lg，l 0500 9地美硝唑 05250 lgr=1107 2lgm
20、一0860 6 tgR=O742 5lgm 0563 25GBT 22949-2008表4(续) 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R替硝唑 o525o lgr=0989 4Igm一0764 6 IgR=0926 1Igm一0591 7羟基化异丙硝唑 05250 lgr=0899 1Igm一0796 8 lgR=0480 S19m一0497 8异丙硝唑 05250 gr-1105 7lgm一0866 6 IgR一0686 1lg，l一0566 8注：m为两次测定值的平均值。表5冻干粉样品基质添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围
21、重复性限r 再现性限R羟基化甲硝咪唑 05250 19r1242 6Igm一0956 4 19R；0764 2lgm一0 594 0甲硝唑 05250 Igr=O989 5IgmO926 2 IgR一0704 2tgm-O597 02一羟甲基一l一甲基化一5一硝咪唑 05250 Igr一1087 7lgm一0987 3 lgR=0737 819m一0 647 9特尼哒唑 05250 lgr=1027 6lgm 0 814 9 19R一0669 819m一0586 6洛硝唑 05250 lgr一0921 5lgm 0999 4 lgR-0736 519m一0654 6地美硝唑 05250 lgr
22、=0874 219m一0926 7 lgR=0404 2lgm一0580 5替硝唑 05250 19r一0，905 9lgm一0860 6 lgR一0625 019m一0609 7羟基化异丙硝唑 05250 lgr=0833 219m 0866 8 gR-0624 Olgm一0649 9异丙硝唑 05250 lgr一0464 2lgm一0812 6 lgRo 160 5lgm0，611 6注：优为两次测定值的平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试的结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的含量范围及再现性方程见表
23、4和表5。6附录A(资料性附录)多反应监测(MRM)色谱图9种硝基咪唑类药物和2种氘代内标物的多反应监测色谱图见图A1。透o霹l羟基化甲硝咪唑；2甲硝唑；32一羟甲基一1一甲基化5硝咪唑；4氘代2羟甲基一1一甲基化一5一硝咪唑；5特尼哒唑6洛硝唑；7地美硝唑8替硝唑；GBT 22949-20089羟基化异丙硝唑；10氘代羟基化异丙硝矬11异丙硝唑。图A1 9种硝基咪唑类药物和2种氘代内标物的多反应监测色谱图7n目目*g目f*e、S目*o上目目fGBT 22949-2008附录B(资料性附录)回收率9种硝基眯唑类药物甲硝唑、地美硝唑、替硝唑、洛硝唑、特尼哒唑、异丙硝唑、羟基化甲硝唑、羟基化异丙硝
24、唑、z一羟甲基一1一甲基化5一硝咪唑在蜂王浆、冻干粉基质中的添加浓度及其平均回收率的实验室内试验数据，见表B1、表B2。表B1 蜂王浆样品基质中9种硝基咪唑类药物的添加浓度和平均回收率试验数据化合物名称 添加浓度(ffgkg) 平均回收率O5 736羟基化甲硝咪唑 10 82920 91905 889甲硝唑 10 9242O 94 505 8812羟甲基一卜甲基化一5一硝咪唑 10 8762 0 94805 960特尼哒唑 10 93220 96705 788洛硝唑 1 0 77420 86305 921地美硝唑 10 83 6Z0 92405 724替硝唑 10 80020 86505 80
25、6羟基化异丙硝唑 1O 839Z0 86205 250异丙硝唑 10 75620 8818GBT 22949-2008表B2冻千粉样品基质中9种硝基咪唑类药物的添加浓度和平均回收率试验数据化合物名称 承加浓度(pgkg) 平均回收率05 806羟基化甲硝眯唑 10 7362o 821o5 74 7甲硝唑 10 74720 90o05 8762一羟甲基一I甲基化一5一硝咪唑 j o 82 42o 90205 874特尼哒唑 10 83920 9110 5 70 o洛硝唑 1 o 71 22 0 818o 5 706地美硝唑 1o 7042 0 83 805 676替硝唑 1O 72 820 834o5 71o羟基化异丙硝唑 10 71220 841o5 795异丙硝唑 1o 71820 8589
