1、ICS 67050X 04 缮雷中华人民共和国国家标准GBT 22950-2008河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中1 2种p一兴奋剂残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of 1 2 p-agonists residues in fngu，eel and baked eelLCMSMS method2008-12-31发布 200905-0 1实施丰瞀嬲紫瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅19刖 置GBT 22950-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出
2、入境检验检疫局、食品安全分析与检测技术教育部重点实验室(福州大学)。本标准主要起草人：杨方、刘正才、林永辉、李耀平、余孔捷、黄杰、陈健、陈国南、庞国芳。1范围河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种肛兴奋剂残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22950-2008本标准规定了河豚鱼，鳗鱼和烤鳗中12种p兴奋剂残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种p兴奋剂多残留的测定。12种p兴奋剂药物包括溴布特罗(brombuter01)、塞曼特罗(cimater01)、克仑特罗(clenbuter01)、克仑潘特(clenpenter01)、羟甲基氨克仑特罗(hydroxymethy
3、lclenbuter01)、苯氧丙酚胺(isoxsuprine)、马布特罗(mabuter01)、莱克多巴胺(ractopamin)、利托君(ritodrine)、沙丁胺醇(salbutam01)、特布他林(terbutaline)和妥布特罗(tulobuter01)。本标准中莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特和克仑特罗的方法检出限为01 pgkg，溴布特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、利托君、苯氧丙酚胺和羟甲基氨克仑特罗的方法检出限为05 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版
4、均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 637912004，IS0 5725 I：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792-2004，ISO 57252：1 994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，Is0 3696：1 987，MOD)3原理样品经稀酸水解
5、、高氯酸沉淀蛋白后，残留的p兴奋剂以乙酸乙酯与异丙醇混合溶剂萃取，混合型阳离子交换反相吸附固相萃取小柱净化，液相色谱一串联质谱进行测定，内标法定量。4试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42异丙醇。43乙酸乙酯。44乙腈：色谱纯。45甲酸。46高氯酸。47盐酸。48氢氧化钠。】GBT 22950-200849乙酸铵：色谱纯。410氨水。411氯化钠。412 10molL氢氧化钠溶液：称取40 g氢氧化钠至100mL水中，混匀。413 01 molL高氯酸溶液：移取04 mL高氯酸至100 mL水中，混匀。414 01 molL盐酸溶液
6、：移取085 mL盐酸至100 mL水中，混匀。415 5 mmolL乙酸铵溶液：称取0385 g乙酸铵至约800 mL水中，加人2 n1L甲酸，定容至1 000 mL，混匀。416 甲醇一01甲酸溶液：移取01 mL甲酸于约50 mL水中，加入10 mL甲醇，以水定容100 mL，混匀。417标准物质：溴布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗，纯度大于980。418内标标准物质：盐酸克仑特罗D9、盐酸莱克多巴胺D5、沙丁胺醇D3，纯度大于980。419标准储备液(100 pgmL)：准确称取适量(精确到0
7、1 mg)的溴布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗，用甲醇分别配制成i00 ttgmL的标准储备液，20冰箱中保存。420混合标准储备液(1 pgmL)：分别准确量取10 mL的标准储备液至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，一20冰箱中保存。421 内标储备液(i00 pgmL)：准确称取适量(精确到O1 mg)的克仑特罗一D9、莱克多巴胺一D5、沙丁胺醇一D3对照品，用甲醇配制成100 pgmL的标准储备液。422内标工作液(10 ngmL)：分别准确量取适量的同位素内标储备液至同一容量瓶中，用甲
8、醇稀释定容成浓度为10 ngmL的同位素内标工作液，一20下冰箱中保存。423基质标准工作溶液：以空白基质溶液将混合标准储备液与内标工作液稀释至适当浓度，临用现配。424混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱：60 mg3 mL，使用前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，保持柱体湿润。425滤膜：02 pm。5仪器和设备5，1高效液相色谱一串联质谱仪：配电喷雾电离(ESI)源。52天平：感量01 mg和0，01 g。5，3组织捣碎机。54高速冷冻离心机：转速可达15 000 rmin，致冷可达4。55离心机：4 000 rrain。56旋涡振荡器。57电热恒温振荡水槽。58 pH计。5，9旋转蒸发
9、仪。5，10固相萃取装置。511氮吹仪。6试样制备和保存61试样制备河豚鱼、鳗鱼取连皮的鱼肉，将皮、肉分离后取鱼皮置于微波炉中加热后连同鱼肉、鳗鱼制品取所有2可食部分一并放人组织捣碎机均质，充分混匀，装入清洁容器内，并标明标记。制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。62试样保存试样于一18以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在26贮存72 h。7测定步骤GBT 22950-200871提取准确称取5 g(精确到0Ol g)测试样品于50 mL聚丙烯离心管内，加入50 pL 10 ngmL的内标物，加入20 mL 01 molL盐酸溶液(414)，涡旋混匀，于37下避光水浴振荡16
10、 h(过夜)，取出冷却至室温，加入5 mL 01 molL高氯酸溶液(413)，涡旋混匀，4下15 000 rrain离心10 min，分取10 mL上清液转移至另一50 mL离心管内。用10 mdL氢氧化钠溶液(412)调节pH值至97土03，加入约2 g氯化钠后，再加25 mL异丙醇一乙酸乙酯(3+2)，涡动提取2 rain，4 500 rrain离心5 rain，取出上清液至另一50 mL离心管中。再在下层水相中加15 mL乙酸乙酯一异丙醇(7+3)，涡动提取1 min，4 500 rmin离心5 min，合并有机相，40下旋转蒸发至近干，加入5 mL 01 molL盐酸溶液(414)，
11、涡动1 rain，待净化。72净化将71所得溶液以约1 mLmin的流速全部过混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱(424)，依次用3 mL水、3 mL 2甲酸水溶液和2 mL甲醇淋洗，抽干，用5 mL 5氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液于40下以氮气吹至近干，以05 mL甲醇一01甲酸溶液(416)溶解，涡动混匀，过02 pm滤膜(425)，供液相色谱串联质谱仪测定。73空白基质溶液的制备称取阴性样品5 g(精确至001 g)，按71和72步骤操作。74液相色谱一串联质谱测定741液相色谱条件a)色谱柱：Acquity UPLC BEH C18，17 tim，55 mmX 21 ram(内径)或相当者
12、；b)流动相：A为5mmolL乙酸铵溶液(415)，B为01甲酸乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1；表1梯度洗脱程序时间rain A B00 85 151O 85 】520 30 7025 30 7030 85 1550 85 15c)流速：025 mLmin；d)柱温：30；e)进样量：10 t*L。742质谱条件a) 离子源：电喷雾源(ESI)，正离子模式b)扫描方式：多反应监测(MRM)；c)毛细管电压：15 kV；3GBT 22950-2008d)源温度：120；e)去溶剂温度：450；f) 锥孔气流(氮气)：45 Lh,g)去溶剂气流(氮气)：700 Lh,h)碰撞气压(氩气)：2201
13、0 Pa；i)驻留时间：020 s。743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准校准溶液中对应浓度标准校准溶液的保留时间偏差在i25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许的相对偏差 士20 土25 土30 土807432定量测定内标法定量：用混合标准工作溶液
14、分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，标准工作液和待测液中12种药物的响应值均应在仪器线性响应范围内。12种p兴奋剂药物的保留时间、母离子和子离子见表3。12种p兴奋剂药物的标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1，添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。表3 12种p一兴奋剂类药物保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量保留时间 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量化合物名称(m2) (mz) v eV302164 15莱克多巴胺 2oo 302164
15、 25302284 12240148 18沙丁胺醇 075 240148 20240166 13220160 15塞曼特罗 084 220160 18220202 1029I203 15克仑潘特 225 291203 2029l273 10277203 15克仑特罗 215 277203 26277259 11367293 18溴布特罗 220 367293 18367349 13228119 25妥布特罗 213 228154 21228154 164表3(续)GBT 22950-2008保留时间 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量化合物名称 (rez)(研z) V eV311237
16、 16马布特罗 225 311237 20311293 11226125 22特布他林 078 226152 20226152 16288121 20利托君 123 288270 20Z88270 123081150 22苯氧丙酚胺 222 303130 20302284 14293203 15羟甲基氨克仑特罗 195 293203 18293275 12克仑特罗一D9 213 286204 286204 26 15沙丁胺醇一D3 0 75 243151 2431 51 20 18莱克多巴胺一D5 2 00 308168 308168 25 15采用克仑特罗D9定量的化合物有：克仑潘特、克仑特
17、罗、溴布特罗、妥布特罗、马布特罗、苯氧丙酚胺。采用沙丁胺醇一D5定量的化合物有：沙丁胺醇、塞曼特罗、特布他林。采用莱克多巴胺一D5定量的化合物有：莱克多巴胺、利托君、羟甲基氨克仑特罗。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。8结果计算试样中兴奋剂类药物残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：xc筹嬲 (1)式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；v试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m试样溶液最终所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数
18、据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表4。5GBT 22950-2008表4 12种p一兴奋剂类药物的含量范围及重复性和再现性方程单位为毫克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R莱克多巴胺 o，11o lg r=1255 4lg，l 0808 0 lgR一1032 4lg0 498 4沙丁胺醇 0110 lg r=1275 7lgmO494 6 IgR一1038 0 lg m一0501 3塞曼特罗 01
19、10 lg r=1114 8lgm 0780 4 lgR一1015 3 lgm一0503 9克仑潘特 0110 lg r一1079 7lgmO675 2 lgR-0892 6 lgM一0574 2克仑特罗 0 110 lg r=1 006 2Igm 0769 7 lgR一0959 8igm一0497 4溴布特罗 0 550 Ig r一1036 0Ig0 576 2 lgR一1085 8 lgm一0533 9妥布特罗 0550 lgRl 137 8lg0 491 5 lgR-0 940 8lg，n一0582 6马布特罗 055 0 lg r=09981Igm一0 687 3 IgR一1020 5
20、 Igm一0 518 2特布他林 0550 lg0 979 8lg0 705 2 lgR-1038 7lgm一0 481 0利托君 0550 lg r=0965 419m 0712 9 lgR一0973 5 Igm一0481 6苯氧丙酚胺 0550 lgRl 122 8lg0 814 2 19R-0950 5 lgm一0501 4羟甲基氨克仑特罗 0 550 lg r一1017 019 m-u0 718 2 19R一0979 4 lg卅一0468 0如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9，3再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R
21、，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表4。附录A(资料性附录)标准物质的多反应监测(MRM)色谱图12种p一兴奋剂类药物标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图A1。巳，二：!一二二二 100 2 00 3 00 4 00 5 00“175 沙丁胺醇24“11L盐x00刁2003而00丽400 5 001fj“f5 沙丁胺醇_D3 24 311，i，一1 00 2 00 3 00 4 00 5 00raintrainj一，j二二二二二二l_00 2 00 300 4 00 5 00LI+二，二二1 00 2 00 3 OO 4 00 5 00一一正，二!，二三。 l-00 2 00 3 00
22、4 00 5 00GBT 22950-2008L疋，二，二二。irainI00 2 00 300 4 00 5 00222 苯氧丙酚胺 30248150 331 00 2 OO 3 00 4 00 5 00min2 25 马布特罗 310 96236 67溴布特罗tminl00 200 3 00 4 00 500图A1 12种p一兴奋剂类药物标准物质的多反应监测(MRM)色谱图tmm7ooo0oooo00ooooGBT 22950-2008附录B(资料性附录)回收率12种p兴奋剂类药物的添加浓度及其回收率范围的试验数据见表B1。表B1 12种p一兴奋剂类药物的添加浓度及其回收率范围的试验数据平
23、均回收率化合物名称 添加浓度(pgkg)河豚鱼 鳗鱼 烤鳗o1 904 810 848o2 889 81 5 841莱克多巴胺o5 899 825 86o1o 947 843 87201 89 7 848 88Oo2 90 7 844 870沙丁胺醇o5 909 887 85o10 908 87 1 88701 866 852 87 4o2 906 939 832塞曼特罗O5 92 4 872 85o1o 91 8 895 8890 1 877 868 842o 2 873 895 84o克仑潘特05 904 86 9 87 610 899 873 880o1 85 6 885 864o2 8
24、71 90 4 849克仑特罗o5 917 896 8671o 82o 933 811o1 894 867 837O2 92 5 935 847溴布特罗o5 902 905 8771o 927 909 86605 905 895 86o1o 928 918 850妥布特罗25 957 932 8995 o 92 9 92o 90o表B1(续)GBT 22950-2008平均回收率化合物名称 添加浓度(#gkg)河豚鱼 鳗鱼 烤鳗o5 905 828 8561 o 9l 4 89Z 855马布特罗2 5 906 912 8645o 908 969 869o5 888 859 9141o 874 921 89 8特布他林Z5 916 946 93 55o 892 91 9 90 3o5 888 83 9 87 61o 942 838 874利托君25 935 842 8765o 91 1 90o 907o 5 88 o 824 90 81o 90o 863 85 5苯氧丙酚胺25 90o 873 8695o 93 7 919 875o，5 908 873 90 21o 90，7 946 901羟甲基氨克仑特罗2 5 915 973 8885o 9l 8 951 9139
