1、ICS 67050X 04 a园中华人民共和国国家标准GBT 22953-2008河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定 液相色谱一串联质谱法Determination of ivermectin，abamectin，doramectin and eprinomectinresidues in fugu，eel and baked eelLCMSMS method200812-31发布 2009-05-0 1实施宰瞀徽鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会及111刖 昌GBT 22953-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督
2、检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：林峰、吴映璇、姚仰勋、欧阳少伦、林海丹、庞国芳。河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22953-20081范围本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中阿维菌素类药物伊维菌素(ivermectin)、阿维菌索(abamectin)、多拉菌素(doramectin)和乙酰氨基阿维菌素(eprinomectin)残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼肌肉、鳗鱼肌肉、烤鳗中伊维菌素、阿维菌素、多
3、拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定。本标准的方法检出限：河豚鱼肌肉、鳗鱼肌肉、烤鳗中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素均为5 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与
4、结果的准确度(正确度与精密度) 第z部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，IS0 3696：1987，MOD)3原理河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中残留的伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留用乙腈提取后，正已烷脱脂，中性氧化铝柱净化。样品溶液供液相色谱一串联质谱仪检测，外标峰面积法定量。4试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的级水。41乙腈：色谱纯。42甲醇。43正己烷，使用前以乙腈饱和。4，4中性氧化铝：活度I
5、级。4，5无水硫酸钠：经650灼烧4 h，置于干燥器中备用。46中性氧化铝净化柱：取一空的固相萃取柱管，下部填人少量脱脂棉，装入2 g中性氧化铝(44)，上部再填充4 g无水硫酸钠，使用前装填。47伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿维菌素标准物质：纯度99。48 100-gmL标准储备液：准确称取适量的伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素标准品(精确至01 mg)，用乙腈分别配制成100 pgmL的标准贮备液，一18储存。1GBT 22953-200849 0500 pgmL混合标准工作液：准确吸取0500 mL伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素标准储备液(48)至
6、100mL容量瓶中，以乙腈稀释并定容，此混合工作液的浓度为0500#gmL。一20储存。410基质混合标准工作溶液：根据需要，吸取不同体积的混合标准工作液(49)，用空白样品提取液配制成不同浓度的基质混合标准工作溶液，使用前配制。411滤膜：02 p-m。5仪器和设备51液相色谱一串联四极杆质谱仪，配有电喷雾电离源。52分析天平：感量01 mg和001 g。53组织捣碎机。54匀浆机：转速大于或等于8 000 rmin。55离心机：转速大于4 000 rmin。56超声波水浴。57液体混匀器。58固相萃取装置。59氮吹仪。6试样的制备与保存取样品约500 g用组织捣碎机捣碎，装入洁净容器作为试
7、样，密封，并标明标记，于一18冰箱中保存。制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。7测定步骤71提取准确称取2 g组织样品(准确至001 g)至50 mL离心管中，加入8 mL乙腈(41)，匀浆机上8 000 rmin均质20 s，4 000 rrain离心5min，上清液转移至50mL离心管中；另取一50mL离心管加入8 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，液体混匀器上振荡30 S，4 000 rmin离心5 rain，上清液合并至50 mL离心管，离心管中的沉淀再加入6 mL乙腈，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，液体混匀器上振荡30 s
8、，4 000 rrain离心5 rain，上清液合并至50 mL离心管中，乙腈定容至250 mL刻度，混匀备用。72净化向上述装有样品提取液的50 mL离心管中加入10 mL乙腈饱和的正己烷(43)脱脂，涡旋振荡1 min，4 000 rmin离心5 min，弃去上层正己烷，重复此操作一次，下层乙腈溶液待用。将中性氧化铝净化柱(46)安置在固相萃取装置上，准确移取100 mL已脱脂的样品提取液至中性氧化铝净化柱中，控制流速在1 mLmin2 mLmin，用2 mL2乙腈淋洗净化柱，收集全部流出液，流出液转移至吹氮管中，50下氮气吹至于，用100 mL乙腈溶解残渣，并置超声波水浴中超声振荡10
9、min，02 pm滤膜(411)过滤，供液相色谱一串联质谱测定。73测定条件731液相色谱参考条件a)色谱柱：Intersil C83柱，5 pm，150 mmX46 mm(内径)或相当者；b)柱温：40；c) 进样量：25 pL；2d)流速：08 mLmin；e)流动相：甲醇+水，梯度洗脱，见表1。表1梯度洗脱程序GBT 22953-2008时间rain 甲醇“ 水000 75 2S300 100 01000 100 O1001 75 251500 75 25732质谱参考条件a)离子源：电喷雾电离源(ESI)；b)扫描方式：负离子扫描；c)检测方式：多反应监测(MRM)；d)雾化气、气帘气
10、、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最佳灵敏度；e)监测离子对和相应的参考质谱参数，见表2。表2伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素的监测离子对和相应的参考质谱参数定性离子对 定量离子对 栗集时间 去簇电压 碰撞能量化合物名称(mz) (mz) V V87375678 37伊维菌素 8737229 2 100 75873，7Z292 5087175652 一40阿维菌素 87175652 100 808717，i2293 548976，5914 38多拉菌素 8976s912 1
11、00 708976，2290 51912，5，IZ700 49乙酰氨基阿维菌素 91255654 100 8212515654 37733液相色谱一串联质谱测定7331定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准溶液谱图中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 i0K20 K10允许最大偏差 20 土25 土
12、30 土507332定量测定外标法定量：在仪器最佳工作条件下，对基质混合标准工作溶液进样(410)，以峰面积为纵坐标，基3GBT 22953-2008质混合标准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。四种阿维菌素的标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1图A4。四种阿维菌素的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B。1。74平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。75空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。8结果计算河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素的
13、残留量按式(1)计算：xc筹糕 (1)m 1 UUU式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(vgkg)；c从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；V样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m一一样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表4、表5、表6。表4添加浓度范围及重复性和再现性
14、方程(基质为河豚鱼肌肉)单位为微克每千克化合物名称 舔加浓度范围 重复性限r 再现性限R伊维菌素 550 r一0243m 024Z R一0273孵阿维菌素 550 r一0 325m一076 R一0261 72m+0277多拉菌素 550 r-0228m+0072 lg R一096519 m一0591乙酰氨基阿维菌素 550 19 r-13919，z一105 R一0376m143注：m为两次测定结果的算术平均值。表5添加浓度范围及重复性和再现性方程(基质为鳗鱼肌肉)单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R伊维菌素 550 r一0109m+0367 R一0217m一0188
15、阿维菌素 550 r-0234m 0702 R一019lm+0149多拉菌素 550 r一0229m一0363 R一0262，l一0587乙酰氨基阿维菌素 550 r-0199m一0 563 R一0203m一0 240注：m为两次测定结果的算术平均值。4GBT 22953-2008表6 添加浓度范围及重复性和再现性方程(基质为烤鳗) 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R伊维菌素 550 lg r=088319 m一0583 19R一115lgm 0875阿维菌素 550 r一0252m一0771 R一0288删0 775多拉菌素 SSO r一0239m一0020 R
16、一023Zm+0214乙酰氨基阿维菌素 550 7-=0295m一1200 R一0248m一0478注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表4、表5、表6。GBT 22953-2008附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素标准物质多反应监测(MRM)色谱图见图A1图A4。i 5e4靼 1 Oe4捌罾6 11 2 3 4 5 6 7 8tmln图A1 阿维菌素标
17、准物质的多反应监测(MRM)色谱图|I 一九 一l 2 3 4 5 6 7 8图A2伊维菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图【 一l 2 3 4 5 6 7 8train图A3 多拉菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图o05O5O5111导掣趟香400OO0kO000O叭mmmmm00OOl00008642导犁迸誉GBT 22953-2008图A4 乙酰氨基阿维菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图；00eee050OOzii5争掣趔香GST 22953-2008附录B(资料性附录)回收率伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素的添加浓度及其平均回收率试验数据见表B1。表B1
18、伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素的添加浓度及其平均回收率试验数据样品基质 化合物名称 添加水平(pgkg) 平均回收率5 101210 1041伊维菌素20 i03050 9975 104910 964阿维菌素20 104450 1027河豚鱼肌肉92210 964多拉菌素20 93250 9615 1017lO 8S?乙酰氨基阿维菌素20 86450 8995 95710 992伊维菌素20 100050 10465 95210 102O阿维菌素20 99450 1016鳗鱼肌肉5 80110 97 3多拉菌素20 102050 9305 83210 926乙酰氨基阿维菌素20 86150 9688表B1(续)GBT 22953-2008样品基质 化合物名称 添加水平(pgkg) 平均回收率5 96710 1040伊维菌素20 92050 103o5 105o10 983阿维菌素20 106050 1060烤鳗5 85310 970多拉菌素20 91350 10105 87910 902乙酰氨基阿维菌素20 89850 10409
