1、ICS 67050X 04 园雪中华人民共和国国家标准GBT 2296 12008河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱一紫外检测法Determination of oxytetracycline，tetracycline，chlOrtetracycline，doxycycline residues in fugu and eelHPL(UV method2008-12-31发布 2009050 1实施车瞀鹛紫瓣警襻瞥霎发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 菁GBT 229612008本标准修改采用AOAC标准99509可食动物组织中土霉素、四环素、金霉素残留量的测
2、定液相色谱法。本标准与AOAC标准相比主要技术差异如下：c，s固相萃取柱改为Oasis HLB固相萃取柱。淋洗液由甲醇改为乙酸乙酯。增加了羧酸型阳离子交换柱净化。增加了测定品种。本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曹彦忠、石玉秋、贾光群、顾晓鹏、庞国芳。1范围河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱一紫外检测法GBT 2296 12008本标准规定了河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱一紫外检测方法。本标准适用于河豚鱼、鳗鱼中土霉
3、素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。本标准的方法检出限均为0010 mgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注13期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注13期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 铡量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总砌与定义(GBT 637912004，【S0 5725 1：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第z部分：确定标准测量方法重复
4、性与再现性的基本方法(GBT 63792 2。04，IsO 5725-2：1994，1DT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1 987，MOD)3原理用01 molL Na：EDTAMcllvaine(pH=4o005)缓冲溶液提取河豚鱼、鳗鱼中四环素族抗生素残留，提取液经离心后，上清液用Oasis HLB”或相当的固相萃取柱和羧酸型阳离子交换柱净化，液相色谱一紫外检测器测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44乙酸乙酯：色谱纯。45正己烷：
5、色谱纯。46柠檬酸(C。H。O，H。0)。4。7磷酸氢二钠。48乙二胺四乙酸二钠(Na：EDTA2H。0)。4，9草酸。410甲酸：优级纯。1)Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1GBT 2296 12008411 01 molL柠檬酸溶液：称取2101 g柠檬酸(46)，用水溶解，定容至1 000 mL。412 02 molL磷酸氢二钠溶液：称取2841 g磷酸氢二钠(47)，用水溶解，定容至1 000 mL。413 Mcllvaine缓冲溶液：将
6、1 000 mL 01 molL柠檬酸溶液(411)与625 mL 02 molL磷酸氢二钠溶液(412)混合，用NaOH或HCl调pH一40士005。414 01 molL NazEDTAMcllvaine缓冲溶液：称取605 g乙二胺四乙酸二钠(48)放人1 625 mLMcllvaine缓冲溶液(413)中，使其溶解，摇匀。415 001 molL草酸溶液：称取126 g草酸(49)用水溶解，定容至1000 mL。416 2甲酸溶液：量取2 mL甲酸(410)，用水稀释至1 000 mL。417甲醇溶液(1+19)：量取5 mL甲醇(42)和95 mL水混合。418洗脱液：乙腈一甲醇一0
7、01 molL草酸溶液(2+1+7)。419土霉素(CAS：205846一o)、四环素(CAS：64755)、金霉素(CAS：64722)、强力霉素(CAS：24390-145)标准物质：纯度95。420 01 mgmL标准储备溶液：准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质(419)，分别用甲醇配成o1 mgmL的标准储备液。储备液于一18贮存。421 60 pgmL中间浓度混合标准溶液：分别吸取06 mL标准储备溶液(420)移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成60 pgmL的标准混合溶液。该溶液于一18贮存。422混合标准工作溶液：用洗脱液将中间浓度混合标准溶液(421)稀释
8、成0005 ugmL、0010,gmL、0050tgmL、0100 pgmL、0200 pgmL不同浓度的混合标准工作溶液，混合标准工作溶液需当天配制。423 Oasis HLB固相萃取柱或相当者：500 mg，6 mL。使用前分别用5 mL甲醇和10 mL水预处理，保持柱体湿润。424阳离子交换柱：羧酸型，500 mg，3 mL。使用前用5 mL乙酸乙酯预处理，保持柱体湿润。425滤膜：02 pm。5仪器51液相色谱仪：配有紫外检测器。52分析天平：感量01 mg，001 g。53液体混匀器。54固相萃取装置。55贮液器：50 mL。56高速冷冻离心机：最大转速13 000 rmin。57刻
9、度样品管：5 mL，精度为01 mL。58真空泵：最大真空度80 kPa。59振荡器。510具塞聚丙烯离心管。511 pH计：测量精度士002。6试样的制备与保存61试样的制备从全部样品中取出有代表性样品约1 kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。62试样保存将试样于一18冷冻保存。2GBT 2296 1一20087测定步骤71提取称取6 g试样，精确到001 g，置于50 mL具塞聚丙烯离心管(510)中，加入20 mL Na：EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(414)，于液体混匀
10、器(53)上快速混合1 min，再用振荡器(59)振荡10 min，10 000 rmin离心10 min，上层提取液倒入另一具塞离心管中，残渣中再加入15 mL NazEDTA-Mcllvaine缓冲溶液，重复提取一次，合并提取液。鳗鱼样品的提取液中加入20 mL正己烷，振荡5 min，以4 000 rmin离心5 min，弃去正己烷相，水相部分待净化。72净化将提取液(71)倒入下接Oasis HLB固相萃取柱(423)的贮液器(55)中，提取液以小于3 mLmin的流速通过固相萃取柱，待提取液完全流出后，用5 mL甲醇溶液(417)洗柱，弃去全部流出液。固相萃取柱减压抽干40 rain，
11、然后用15 mL乙酸乙酯(44)洗脱，下接预先处理好的阳离子交换柱(424)，调节流速小于3 mLmin，待乙酸乙酯全部流出后，取下Oasis HLB柱，用5 mL甲醇淋洗阳离子交换柱，弃去全部流出液。阳离子交换柱减压抽干5 min，再用4 mL洗脱液(418)洗脱，收集洗脱液于5 mL样品管中，定容至4 mL，过02 pm滤膜后，供液相色谱一紫外检测器测定。73测定条件731液相色谱参考条件a)色谱柱：BEH C。8，17 pm，50 mmX 21 mm(内径)或相当者；b)流速：04 mLmin；c)柱温：30；d)检测波长：350 nm：e) 进样量：10 pL；f)流动相：A：乙腈，B
12、：2甲酸溶液，梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件时间min 流速(mLmin) A B000 04 O 100050 04 lO 90150 04 30 70250 04 74 26251 04 0 100400 04 O 100732液相色谱测定将混合标准工作溶液(422)分别进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间见表2。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准液相色谱图参见附录A中的图A1。本方法中土霉素
13、、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。3GBT 229612008表2土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间化合物中文名称 化合物英文名称 保留时间rain土霉素 oxytetracycline 125四环素 tetracycline l35金霉素 chlortetracycline 167强力霉素 doxycycline 17774平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。75空白试验除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。8结果计算河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定结果按式(1)计算。xc羔揣 (1)m l
14、 UUU式中：x试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克(mgkg)；c从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(PgmL)；y样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度范围及重复性方程见表3。表3添加滚度范围及重复性和再现性方程 单位为毫克每千克化合物
15、名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R土霉素 00100100 lg r一0766 219m一0913 3 lgR一0747 llgm一0589 3四环素 00100 i00 Ig r-0823 619n1 000 7 lgR-0791 219m一0662 3金霉紊 00100100 lg r一0657 3g一0736 1 lgR一0648 Olg0 410 6强力霉索 00100100 lg r-1117ltg1 514 2 lgR-1009 6lgm一1013 2注；m为两次粳j定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条
16、件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉索、强力霉素的添加浓度范围及再现性方程见表3。4附录A(资料性附录)标准物质液相色谱图土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图见图A1。翘目罂i 00 120 140 1 60 j 80 2 00图A1 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图GBT 2296120085GBT 229612008附录B(资料性附录)回收率本方法中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B1。表B1 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称 添加浓度(mgkg) 平均回收率0010 8160020 827土霉素0050 8160100 85O0010 8900020 849四环素0050 85 80100 8160010 7320020 798金霉素0050 7610100 6640010 6700020 690强力霉素0050 6870 100 651
