1、ICS 67050X 04 缮亘中华人民共和国国家标准GBT 22967-2008牛奶和奶粉中p一雌二醇残留量的测定气相色谱一负化学电离质谱法Determination of p-estradiol residues in milk and milk powderGas chromatography-negative-ion chemical ionizationmass spectrometry method2008-12-31发布 2009-050 1实施宰瞀徽鬻獬訾襻瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪19刖 置GBT 22967-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质
2、量监督检验检疫总局提出并归1：3。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王建华、张艺兵、郭翠、王境堂、孙忠松、庞国芳。1范围牛奶和奶粉中p一雌二醇残留量的测定气相色谱一负化学电离质谱法GBT 22967-2008本标准规定了牛奶和奶粉中口一雌二醇残留量气相色谱一负化学电离质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中p一雌二醇残留量的测定。本标准的方法检出限：牛奶025gkg，奶粉2gkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用
3、于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 5725 l：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，ISO 5725-2：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理牛奶和奶粉中雌二醇经过酶
4、水解，用乙腈作为蛋白沉淀剂和提取剂进行提取，固相萃取柱净化后，经酰化衍生化后，用气相色谱负化学电离质谱选择离子监测模式测定，内标法定量。4试剂和材料除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41 p一葡糖苷酸酶芳基硫酸苷酶：Helix pomatia，每毫升含p葡糖苷酸酶100 000单位，每毫升硫酸酯酶1 000单位。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44乙酸乙酯：色谱纯。45正己烷：色谱纯。46吡啶：色谱纯。47异辛烷：色谱纯。48正丙醇：分析纯。49衍生化试剂：五氟苯甲酰氯，在避光、防潮环境冷冻储藏。410碳酸氢钠。411三水乙酸钠。412氯化钠。413 01乙酸
5、溶液：移取01 mL冰乙酸，用水定容100 mL。1GBT 22967-2008414乙酸钠缓冲液(pH一52)：称取43 g三水乙酸钠(411)用水溶解，加入252 g冰乙酸用水定容至1 000 mL。415干燥乙酸乙酯：在密封试管中加人500 mg无水硫酸钠和20 mL乙酸乙酯，振荡混合约30 rain后，2 000 rrain离心10 min。416 乙酸乙酯一吡啶(9+1)：将10 mL毗啶和90 mL干燥的乙酸乙酯(415)混合，室温保存。417 05 molL碳酸氢钠(NaHCOs)溶液：称5 g NaHCOs于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度。418 Oasis HLB固相萃
6、取柱”或相当者：60 mg，3 mL。使用前分别依次用6 mL甲醇，3 mL 01乙酸溶液和3 mL纯水活化，保持柱体湿润。419标准物质：雌二醇，纯度99。420内标标准物质：p一雌二醇一2，4，16，164氘代(p一雌二醇D4)，纯度99。421 p雌二醇标准溶液：准确称量tomg标准物质(419)分别于100mL容量瓶中，用甲醇(42)定容至刻度，浓度100 pgmL，储备液储存于一20。再以甲醇稀释成适用浓度的溶液，保存于4冰箱中。422内标标准溶液：准确称量10 mg内标标准物质(420)分别于100 mL容量瓶中，用甲醇(42)定容至刻度，浓度100#gmL，储备液储存于一20。再
7、以甲醇稀释成适用浓度的溶液，保存于4冰箱中。423标准工作溶液：将p_雌二醇标准溶液(421)和雌二醇D4内标标准溶液(422)混合，按照73步骤衍生化后备用。5仪器51气相色谱一质谱仪：配有负化学源。52离心管：5 mL和10 mL，具塞。53 移液器：20 pL200 pL，200 pL1 000 pL，1 000 pL5 000zL。54分析天平：感量0。1 mg和001 g。55冷冻离心机：最低温度一4，最大转速10 000 rrain。56涡旋混匀器。57氮气浓缩仪。58水平振荡器。59旋转蒸发仪。510旋涡振荡器。6试样制备与保存61试样的制备611 牛奶：取有代表性试样约500
8、g，搅拌均匀后装人洁净容器内，密封，并做好标识。612奶粉：取有代表性试样约500 g，搅拌均匀后装入洁净容器内，密封，并做好标识。准确称取12 g乳粉试样(精确到001 g)于250mL烧杯中，少量多次加入50mL煮沸并冷却到60左右的水溶解，冷却至室温后，移人100 mL容量瓶中，用少量水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移入容量瓶，再用水定容到刻度，混匀，制备成奶粉复原乳试样。62试样的保存将试样于4保存。21)Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GBT
9、22967-20087测定步骤71提取准确移取20 g牛奶或量取20 mL奶粉复原乳试样(612)置于50mL具塞离心管中，加入5 mL乙酸钠缓冲溶液(414)、约1 g氯化钠(412)，旋涡振荡1 rain后，加入10 mL乙腈(43)，充分旋涡混合l rain，于水平振荡器上(58)剧烈振荡2 min，超声提取10 rain，7 000 rrain于4离心10 rain，用吸管将上清液移入另一离心管。残渣中加入lO mL乙腈，按上述方法再提取一次，合并上清液。上清液中加入10 mL正己烷(45)，剧烈振荡2 rain，7 000 rrain于4离心5 rain，吸正己烷，弃去下层溶液转移至
10、梨形瓶，加入05 mL正丙醇(48)于40C水浴旋转蒸发(约剩余1 mL左右不能完全蒸干)。加人1 mL乙腈，旋涡振荡1 min，转移至10 mL离心管，再用1 mL乙腈清洗瓶一次，溶液转移至上述离心管后，用纯水定容到10 mL。72净化将提取液(71)移入下接Oasis HLB柱(418)的贮液器中，溶液以不大于1 mLmin的流速通过Oasis HLB柱，待溶液完全流出后，用3 mL纯水洗柱，弃去全部淋出液，抽干。最后用9 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于10 mL具塞离心管(52)中，用氮气浓缩仪(57)吹干。73衍生化在上述10 mL具塞离心管中依次加入85 pL干燥的乙酸乙酯(415)，5
11、00 pL乙酸乙酯一吡啶(416)，20 pL五氟苯甲酰氯(49)，混匀，于60放置15 rain后，用氮气浓缩仪吹于。加入500 pL05 molL碳酸氢钠溶液(417)，涡旋振荡，待溶液澄清后准确加入l mL异辛烷，混合提取，静置，取上清液进行测定。74测定条件741 气相色谱一质谱测定参考条件a)色谱柱：HP一5MS，025 pm，30 Ill025 mm(内径)或相当者；b)载气：氦气，纯度99999；c)流速：初始流速10 mLmin，保持5 min，然后以1。0 mLmin速度升至3 mLmin；d)柱温：120保持2 rain，然后以15rain升温至250，再以5min升温至3
12、00保持8min；e)进样量：1“L；f)进样方式：无分流进样；g)进样口温度：300；h)接口温度：280；i)负化学源：150 eV；j)离子源温度：150；k)四极杆温度：106；1)反应气：甲烷，纯度9999；m)反应气流量：2 mLmin；n)选择离子监测：监测离子、丰度比、允许相对偏差见表1。表1 监测离子、丰度t、允许相对偏差监测离子(mz) 丰度比 允许相对偏差660 100661 40 士25448 80 土20450 44 土253GBT 22967-2008742定性测定的依据被测样品色谱峰的保留时间与标准工作溶液相一致；所选择的离子均出现，被测样品的监测离子的相对丰度与
13、标准工作溶液的相对丰度两者之差不大于表1中所列允许相对偏差。743定量测定配制系列标准工作溶液(423)分别进样，仪器测定雌二醇以mz 660为定量离子，内标p雌二醇D4以mz 664为定量离子，以峰面积比对浓度绘制标准工作曲线，用标准工作曲线内标法对样品进行定量，样品溶液中待测物质的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，p雌二醇衍生物参考保留时间约为26 rain。p一雌二醇和内标衍生物总离子流图和质谱图参见附录A中的图A1、图A2、图A3。本方法中牛奶中p雌二醇添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B。75空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。8结果计算牛奶中p-雌二醇
14、的测定结果按式(1)计算：x一会毒等iV器式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(pgkg)；矗基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A一一试样溶液中被测物的色谱峰面积；A。基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；Ci试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；“一一基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A。基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A试样溶液中内标物的色谱峰面积；V一样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；一一试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GB
15、T 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，牛奶中p雌二醇的含量在025 pgkg20 pgkg范围内，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，本标准的重复性限按式(2)计算：r一0239 9 m一0013 8 (2)式中：m口一雌二醇测定值的浓度，单位为微克每升(pgL)。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，牛奶中p一雌二醇的含量在025 pgkg2o pgkg范围内，获得的两次独立4测试结果的绝对差值不超过再现性限R，本标准的再现性限按式(3)
16、计算R一0286 7 m+0010 3式中：mp雌二醇测定值的浓度，单位为微克每升(pgL)。GBT 22967-2008(3)GBT 22967-20086丰度280 000260 000240 000220 000200 000180 000160 000140 000120 000100 00080 00060 00040 00020 000丰度1 400 0001 200 0001 000 000800 000400 000200 000附录A(资料性附录)雌二醇和内标衍生物总离子流图和质谱图图A1 雌二醇和内标衍生物总离子流图50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800图A2雌二醇标准物质衍生物质谱图丰度i00 00090 00080 00070 00060 00050 00040 00030 00020 00010 000m=10 20 30 40 50 60 70图A3雌二醇D4标准物质衍生物质谱图附录B(资料性附录)回收率本方法中牛奶中目一雌二醇添加浓度及其平均回收率的试验数据在o25 vgkg时，平均回收率为953；在05 pgkg时，平均回收率为897；在10 vgkg时，平均回收率为841；在20,gkg时，平均回收率为871。GBT 22967-2008
