1、ICS 67050X 04 囝雷中华人民共和国国家标准GBT 22976-2008牛奶和奶粉中if,一群勃龙、p一群勃龙、1 9一乙烯去甲睾酮和epi一1 9一乙烯去甲睾酮残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of c-trenbolone，p-trenbolone，nortestosterone andepinortestosterone residues in milk and milk powderLCMSMS method2008-12-31发布 2009050 1实施宰瞀髅鬻瓣警襻瞥翼发布中国国家标准化管理委员会仅111刚 吾GBT 22976-2008本标准的
2、附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：艾连峰、王风池、段文仲、郭春海、马育松、贾海涛、刘宝圣、勾金玉、庞国芳。牛奶和奶粉中一群勃龙、群勃龙、19一乙烯去甲睾酮和epi一19一乙烯去甲睾酮残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22976-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中a一群勃龙、群勃龙、19一乙烯去甲睾酮和epi一19-乙烯去甲睾酮残留量的高效液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中a一群勃龙、p群勃龙、19一乙烯去
3、甲睾酮和epi_19一乙烯去甲睾酮残留量的测定和确证。本标准方法的检出限：牛奶中a群勃龙、群勃龙、19一乙烯去甲睾酮和epi一19一乙烯去甲睾酮为1gkg，奶粉中a一群勃龙、p群勃龙、19一乙烯去甲睾酮和epi-19一乙烯去甲睾酮为5 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GB
4、T 63791-2004，IS0 5725 1：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(iE确度与稽密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 57252：1 994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1 987，MOD)3原理试样在pH50条件下加酶水解，乙腈一乙酸乙酯提取，凝胶色谱净化，用高效液相色谱一串联质谱测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为液相色谱纯，水为GBT 6682规定的一级水。41 乙腈。42乙酸乙酯。43环己烷。44
5、甲醇。45乙酸。46无水硫酸钠，分析纯：经650灼烧4 h，置于干燥器内备用。47乙酸钠，分析纯。48 p葡萄糖苷酸酶芳基硫酸酯酶：p91ucuronidasearyl sulfatase，100 000 unitmL。49 002 molL乙酸钠缓冲液(pH一5o)：称取无水乙酸钠082 g溶于500 mL水中，用乙酸调节pH一50。1GBT 22976-2008410甲醇溶液(7+3)：30体积的水与70体积的甲醇混匀。411 乙酸乙酯一环己烷(1+1)：50体积的乙酸乙酯与50体积的环己烷混匀。412 p群勃龙(a-trenbolone，CAS：80657176)、p群勃龙(B-tren
6、bolone，CAS：10161338)、19一乙烯去甲睾酮(nortestosterone，CAS：434220)和epFl9一乙烯去甲睾酮(epi-nortestosterone，CAS：440934一1)标准品：纯度大于等于98。413标准储备液：分别精确称取适量标准品，用乙腈配制成100 pgmL的标准储备液。414混合标准中间工作液：取标准储备液(413)各1mL至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成混合标准工作液，浓度为1tgmL。415滤膜：045 p-m。5仪器和设备51高效液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。52凝胶色谱仪。53分析天平：感量01 mg和
7、001 g。54离心机。55恒温水浴摇床。56涡旋混和器。57旋转蒸发仪。6试样的制备与保存61牛奶取均匀样品约250 g装入洁净容器作为试样，密封置4下保存，并标明标记。62奶粉取均匀样品约250 g装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。7测定步骤71提取牛奶样品称取约5 g(准确至001 g)于50 mL具塞离心管中，奶粉样品称取约1 g(准确至001 g)并加入5 mL水于50 mL具塞离心管中，混匀。在称取好样品的离心管中加入5 mL乙酸钠缓冲液和20 pL p_葡萄糖苷酸酶芳基硫酸酯酶，摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床上，37振荡水解过夜。待水解液冷却至室温后，首先加入5 mL乙腈，
8、振摇，以沉淀蛋白，然后再加入20mL乙酸乙酯，涡旋振荡提取2rain后，3 000 rmin离心10min，移取上清液通过5 g无水硫酸钠过滤至鸡心瓶中。再用20 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。72净化721凝胶色谱参考条件凝胶色谱参考条件如下：a)净化柱：22 g S-X3 BioBeads填料，200 mmX 25 mm(内径)或相当者；b)流动相：乙酸乙酯一环己烷(411)，流速：50 mLmin；c)定量环：5 mL；d)净化程序：0 min10 rain弃去洗脱液，10 min155 min收集洗脱液。722凝胶色谱净化将提取液在45下蒸至近于，用乙酸乙酯一环己
9、烷(1+1)定容至10 mL的玻璃试管中，按721的条件净化。净化后将收集的洗脱液蒸干，用1 mL甲醇溶液(410)旋涡振荡溶解，过o45 p-m滤膜供2GBT 22976-2008HPLCMS-MS分析。73空白基质溶液的制备将取牛奶阴性样品5 g，奶粉阴性样品1 g(精确到0Ol g)，按71和72操作。74测定条件741液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：C185 pm，150 mm21 mm(内径)或相当者；b)色谱柱温度：30；c) 进样量：20 pL；d) 流动相梯度及流速见表1。表1液相色谱梯度洗脱条件时间rain 流速(pLmin) 01乙酸水溶液 乙腈000
10、200 80 20600 200 65 358 OO 200 65 35810 200 80 20100 200 80 20742质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+)b)质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；c)鞘气压力：104 kPa；d)辅助气压力：138 kPa；e)正离子模式电喷雾电压(IS)：4 000 V；f)毛细管温度：320；g)源内诱导解离电压：10 V；h)Q1为04，Q3为07；i)碰撞气：高纯氩气；j)碰撞气压力：02 Pa；k)其他质谱参数见表2。表2被测物的参考保留时间、采集窗口、监测离子对和裂解能量化合物名称 保留时间min 检
11、测离子对(mz) 裂解能量eV2711Gz53 08 21B群勃龙 8932711619908 212711 6253088 21群勃龙 9472711619908 212751883910 1519乙烯去甲睾酮 10282751825712 252751823910 15epi 19乙烯去甲睾酮 11642751825712 258为定量离子对，对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。GBT 22976-2008743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与混合基质标准校准溶
12、液中对应的保留时间偏差在25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证对相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许最大偏差 20 土25 土30 土507432定量测定在仪器最佳工作条件下，对混合基质标准校准溶液进样，以峰面积为纵坐标，混合基质校准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下，标准物质多反应监测(MRM
13、)色谱图参见附录A中的图A1。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76回收率试验吸取适量混合标准工作溶液，用空白基质溶液(73)稀释成所需浓度的标准校准溶液。阴性样品中添加标准溶液，按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率，回收率范围参见附录B中的表B1。8结果计算试样中分析物的残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：xc筹揣 (1)式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作血线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；v样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9
14、精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表4和表5。表4 牛奶中四种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R群勃龙 110 lg r=1304 6Igm 1025 9 lgR；1005 Igm 0690 2铲群勃龙 110 lg r=0827 8lg0 781 1 lgR一0941 5 lg m_u0 636 719乙烯去甲
15、睾酮 110 lg r=0912 i Ig m_u0 860 3 lgR=0904 9Ig m_u0 5791epi一19一乙烯去甲睾酮 110 lg r一1186 8lg0 971 1 lgRO888 8lg0 597 5注：m为两次测定结果的算术平均值。GBT 22976-2008表5奶粉中四种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R群勃龙 550 lg，一1178 5lg1 209 4 lgR-1299 3 lgm一0951 7口-群勃龙 550 lg r=O774 9lgm一0532 6 lgR一0913 5 lgm一06
16、68 219-乙烯去甲睾酮 550 lg r=0820 5Igm 0551 8 lgR一0851 3 Ig m_u0 761 8epi 19乙烯去甲睾酮 550 lg r=0862 9Igm 0794 4 lgR一0702 919m一0450 4注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表4和表5。GBT 22976-2008附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图a一群勃龙、群勃龙、19一乙烯去甲睾酮和epi
17、一19一乙烯去甲睾酮标准物质多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。6RT：947奎j 6j 凰L一一，一一kl1*群勃龙52群勃龙319乙烯去甲睾酮；4eprl9一乙烯去甲睾酮。图A1 标准物质多反应监测(MRM)色谱图帆螂觚榔弛。懈腓雠枷l毫。蜥晰瞄螂旨。雠瞄懈l等。附录B(资料性附录)回收率GBT 22976-2008a一群勃龙、群勃龙、19一乙烯去甲睾酮和epi一19一乙烯去甲睾酮的添加浓度及其回收率范围数据，见表B1。表B1 *群勃龙、p群勃龙、19一乙烯去甲睾酮和epi一19一乙烯去甲睾酮的添加浓度及其回收率范围数据牛 奶 奶 粉化合物名称添加浓度(pgkg) 回收率范围 添加浓度(
18、Fgkg) 回收率范围1 76o910 5 7529562 745910 10 75693o群勃龙5 736906 25 70589410 774942 50 74o97o1 73094 o 5 7509582 73596 0 10 755886群勃龙5 744960 2j 76798210 799925 50 77o9281 750900 5 7829642 74094o 10 73889019一乙烯去甲睾酮5 78o978 25 82399010 807882 50 74 496 21 760960 5 8149602 755925 10 718946epi一19一乙烯去甲睾酮5 768950 25 80898110 76 1967 50 810935
