1、ICS 67050X 04 园亘中华人民共和国国家标准GBT 22989-2008牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of cefapirin，cephalexin，cefalonium，cefquinomeresidues in milk and milk pOwderLCMSMS method2008-12-31发布 2009-05-0 1实施丰瞀鹘鬻瓣警雠瞥星发布中国国家标准化管理委员会促1”刖 罱本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归日。本标准起草单位：中华人民
2、共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李学民、母健、曹彦忠、刘晓茂、钱小清、庞国芳。GBT 22989-2008牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22989-20081 范围本标准规定了牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定。本标准牛奶的方法检出限：头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟为40 pgkg；奶粉的方法检出限为：头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟为32 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条
3、款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，IS0 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水
4、规格和试验方法(GBT 66822008，ISO 3696：1987，MOD)3原理试样中四种头孢菌素类药物残留，用乙腈、磷酸盐缓冲溶液提取，固相萃取柱净化，液相色谱串联质谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44磷酸二氢钠(NaH。PO。)。45氢氧化钠：优级纯。46乙酸。47正己烷。48乙腈一水溶液(3+1)：量取60 mL乙腈(43)和20 mL水充分混合。49乙腈饱和的正己烷：取100 mL正己烷(47)和50 mL乙腈于250 mL分液漏斗中，振摇1 min，静置分层后，弃掉乙腈。410
5、 5molL氢氧化钠溶液：称取20 g氢氧化钠(45)，用水溶解，定容至100mL。411 010molL磷酸二氢钠缓冲溶液：称取120 g磷酸二氢钠(44)，用水溶解，定容至1 000mL，1GBT 22989-2008然后用氢氧化钠溶液(410)调节至pH一85。412标准物质：头孢匹林(cAs：24356 603)、头孢氨苄(cAs：1654956 7)、头孢洛宁(CAS：5575213)、头孢喹肟(cAS：118443893)，纯度大于等于99。413 10 mgmL四种头孢菌素标准储备溶液：准确称取适量的每种标准物质(412)，分别用水配制成浓度为10 mgmL的标准储备溶液。储备液
6、贮存在一18冰柜中。414 四种头孢菌素标准混合工作溶液：根据需要吸取适量的每种头孢菌素标准储备溶液(413)，用水制成适当浓度的混合标准工作溶液。415 Oasis HLB固相萃取柱”或相当者：500 mg，6 mL。使用前依次用5 mL甲醇(42)、5 mL水和10 mL磷酸二氢钠缓冲溶液(411)预处理，保持柱体湿润。416滤膜：02 pm。5仪器51 液相色谱一串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。52分析天平：感量01 mg、001 g。53固相萃取真空装置。54贮液器：50 mL。55微量注射器：25 pL，100 pL。56均质器。57高速冷冻离心机：带有50 mL具塞离心管，转速
7、达到10 000 rmin以上。58刻度样品管：5 mL，精度为01 mL。59旋转浓缩仪。510氮气浓缩仪。6试样制备与保存61试样的制备从全部样品中取出有代表性样品约1 kg，充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封后作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。62试样的保存将试样于一18保存。7测定步骤71试样溶液的提取711牛奶称取5 g试样(精确到001 g)置于50 mL离心管中，加人20 mL乙腈(43)，使用均质器(56)均质1 min，提取液使用高速冷冻离心机(57)在lo10 000 rmin离心10 rain，把上层提取液
8、移至另一离心管中。用15 mL乙腈一水溶液(48)重复提取一次，合并两次的提取液，并加入10 mL乙腈饱和的正己烷(49)，振荡1 min，弃掉正己烷。把提取液移至100 mL鸡心瓶中，在40用旋转浓缩仪(59)旋转蒸发除去乙腈。712奶粉称取05 g试样(精确到001 g)置于50 mL离心管中，加入40 mL水，使奶粉充分溶解，加入21) Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GBT 22989-200820 n止乙腈(43)，使用均质器(56)均质1
9、rain，提取液使用高速冷冻离心机(57)在1010 000 r商n离心10 min，把上层提取液移至另一离心管中。用15 n1L乙腈一水溶液(48)重复提取一次，合并两次的提取液，并加入10mL乙腈饱和的正已烷(49)，振荡1 rain，弃掉正己烷。把提取液移至100mL鸡心瓶中，在40用旋转浓缩仪(59)旋转蒸发除去乙腈。72试样溶液的净化向已除去乙腈的样品溶液中加入20 mL磷酸二氢钠缓冲溶液，然后用氢氧化钠溶液(410)调节至pH=85。把样品提取液移至下接Oasis HLB固相萃取柱(415)的贮液器中，以3 mLmin的流速通过固相萃取柱，先用5 mL磷酸二氢钠缓冲溶液洗涤鸡心瓶并
10、过柱，再用2 mL水洗柱，弃去全部流出液。用2mL乙腈洗脱，收集洗脱液于刻度样品管(58)中，在40氮气浓缩仪(510)吹干，用2mL水溶解残渣，摇匀后，过02 pm滤膜(416)，供液相色谱一串联质谱仪测定。73 空白样品添加标准混合工作溶液的制备731牛奶分别准确移取适量四种头孢菌素标准混合工作溶液(414)，添加到50 g样品中，按照71、72步骤操作，制得头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟浓度分别为40 pgkg、80 pgkg、16 pgkg、40gkg四个样品添加标准混合工作溶液，供液相色谱一串联质谱仪测定。732奶粉分别准确移取适量四种头孢菌素标准混合工作溶液(414)，添加
11、到05 g样品中，按照71、72步骤操作，制得头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟浓度分别为32 pgkg、64 pgkg、128 pgkg、320 pgkg四个样品添加标准混合工作溶液，供液相色谱一串联质谱仪测定。74测定条件741液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：ZORBAX SBC”35 pm，150 mm21 mm(内径)或相当者；b) 流动相组成、流速及梯度程序见表1；c)柱温：30；d)进样量：20 pL。表1 流动相梯度程序及流速时间rain 流速(taLmin) 水(含01乙酸) 乙腈000 200 950 50200 200 95 0 50201 200
12、400 600800 200 400 60080l 200 950 501500 200 950 50742质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d)电喷雾电压：5 500 V；e)雾化气压力：0055 MPaGBT 22989-2008f)气帘气压力：0079 MPa；g)辅助气流速：6 Lmin；h)离子源温度：400；i)定性离子对、定量离子对和去簇电压(DP)、碰撞气能量(cE)见表2。表2 四种头孢菌素的定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞气能量中文名称 英文名称 定性离子对(mz) 定量离子对(m。) 碰撞气能
13、量V 去簇电压V424292 23头孢匹林 424292 45424152 34348158 14头孢氨苄 cephalexin 348158 40348174 22459152 29头孢洛宁 cefalonium 459152 35459123 18529134 21头孢喹肟 529134 49529396 19743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定选择每种待测物质的一个母离子，二个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在25之内；样品谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准溶液的谱图中离子相对丰度相比，偏差不超过表3规定的范
14、围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度(K) K50 20K50 10K20 _F(10允许的最大偏差 土20 25 士30 土507432定量测定用73制备的基质标准混合工作溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作凸线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中四种头孢菌素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，四种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。本方法的添加回收率数据参见附录B中的表B1。75平行试验按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验除不称取
15、试样外，均按上述分析步骤进行。8结果计算试样中四种头孢菌素残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算xc暑獬式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)V试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度GBT 22989-200891一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，
16、试样中四种头孢菌素添加浓度范围及重复性方程见表4。表4 四种头孢菌素添加浓度范围及重复性限和再现性限方程单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R头孢匹林 4o200 19t-1058 9lg1 174 8 lgR一1021 8 lg优0694 5头孢氨苄 40200 lgt-_1061 4lgm 1177 4 kR=1027 0lg0 702 0头孢洛宁 4 0200 lg r一1060 9 lg仇一1177 1 lg R1023 7 lg0 697 1头孢喹脖 40200 Ig r1 065 3lgm一1 188 7 lgR1 0241lgm 0698 5注：m为两次
17、测定结果的算术平均值。如果两次测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，试样中四种头孢菌素添加浓度范围及重复性方程见表4。GBT 22989-2008附录A(资料性附录)标准物质的多反应监测(MRM)色谱图四种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。8 02【 1_raintraintrain图A1 四种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图i|rain邑2五一olu_mAu、h_一三旨i芒一附录B(资料性附录)回收率四种头孢菌素添加浓度及其平均回收率的试验数据，
18、见表B1。表B1 四种头孢菌素添加浓度及其平均回收率的试验数据GBT 22989-2008牛 奶 奶 粉化合物名称添加浓度(pgkg) 平均回收率 添加浓度(pgkg) 平均回收率40 852 32 84680 975 64 90 8头孢匹林16O 851 128 986400 904 320 8674 o 854 3Z 80280 89 7 64 85，6头孢氨苄160 912 128 102，3400 101 5 320 95340 923 32 8578O 1076 64 1012头孢洛宁16 0 893 128 87 1400 9l 7 320 97440 974 32 92680 864 64 89 5头孢喹肟160 1017 128 824400 974 320 87 6
