1、ICS 67050X 04 a园中华人民共和国国家标准GBT 22990-2008牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱一紫外检测法Determination of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline，doxycycline residues in milk and milk powderHPLC-UV method200812-31发布 2009050 1实施宰瞀擞紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会捉们1刖 吾GBT 22990-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量
2、监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国河-tl：出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭春海、窦彩云、陈瑞春、马育松、艾连峰、吕红英、贾海涛、姚春毅、庞国芳。牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱一紫外检测法GBT 22990-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱一紫外检测测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。本标准的方法检出限：牛奶中土霉素、四环素为5 vgkg、金霉素、强力霉素为10 pgkg。奶粉中土霉素、四环素为25
3、 pgkg、金霉素、强力霉素为50 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GBT 637912004，IS0 5726一l：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 6379220
4、04，1sO 5725 2；1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，IsO 3696：1987，MOD)3原理用01 molLNa。EDTAMcllvaine缓冲溶液提取试样中四环素族抗生素残留，Oasis HLB或相当的固相萃取柱和羧酸型阳离子交换柱净化，液相色谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42乙腈：色谱纯。43磷酸氢二钠(Na：HP0。12H。O)。44柠檬酸(C。H。O，-H。0)。45 乙二胺四乙酸二钠(Na。EDTA2H zO)。46草酸(Cz
5、H：042H：O)。47 02 moIL磷酸氢二钠溶液：称取7163 g磷酸氢二钠(43)，用水溶解，定容至1 000 mL。4，8 01 molL柠檬酸溶液：称取2104 g柠檬酸(44)，用水溶解，定容至1 000 mL。49 Mzllvaine缓冲溶液：将625 mL 02 molL磷酸氢二钠溶液(47)与1 000 mL 0I molL柠檬酸溶液(48)混合，必要时用NaOH或HCl调pH-40005。410 01 molL Na：EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：称取6050 g乙二胺四乙酸二钠(45)放人1 625 mLMcllvaine缓冲溶液(49)中，使其溶解，摇匀。1G
6、BT 22990-20084001 molL草酸溶液：称取126 g草酸(46)，用水溶解，定容至1 000 mL。412甲醇一水(1+19)：量取5 mL甲醇(41)与95 mL水混匀。413 001 molL草酸一乙腈溶液(1+1)：量取50 mL草酸溶液(411)与50 mL乙腈(42)混匀。414土霉素(oxytetracycline，CAS：205846一o)、四环素(tetracycline，CAS：64755)、金霉素(chlortetracycline，CAS：64722)、强力霉素(doxycycline，CAS：24390145)标准物质：纯度大于等于96。415 01 m
7、gmL土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液：准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质(414)，分别用甲醇配成01 mgmL的标准储备液。储备液于一20保存。416土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准工作溶液：根据需要用流动相将土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备液(415)稀释成所需浓度的混合标准工作溶液，储存于冰箱中，每周配制。417 Oasis HLB固相萃取柱”或相当者：500 mg，6 mL。使用前分别用5 mL甲醇和10 mL水预处理，保持柱体湿润。418羧酸型阳离子交换柱：500 mg，6 mL。使用前用5 mL甲醇预处理，保持柱体湿润。5仪器51液
8、相色谱仪：配有紫外检测器。52分析天平：感量01 mg，001 g。53涡旋振荡器。54冷冻离心机：转速大于5 000 rmin。55固相萃取装置。56真空泵。57氮气吹干仪。58 pH计：测量精度土002。59刻度样品管：10 mL，精度为01 mL。6试样的制备与保存61试样的制备将牛奶从冰箱中取出，放置至室温，摇匀，备用。62试样保存牛奶置于04冰箱中避光保存，奶粉常温避光保存。7测定步骤71提取牛奶试样称取lo g(精确到001 g)，置于50 mL具塞塑料离心管中。奶粉试样称取2 g(精确到001 g)，置于50 mL具塞塑料离心管中。向试样中加入20 mL 01 molL Na。E
9、DTAMcllvaine缓冲溶液(410)，于涡旋振荡器上混合2 min，于10，5 000 rmin离心10 min，上清液过滤至另一离心管中。残渣中再加入20 mL缓冲溶液，重复提取一次，合并上清液。72净化将上清液(71)通过处理好的Oasis HLB柱(417)，待上清液完全流出后，用5 mL甲醇一水(412)淋洗，弃去全部流出液。减压抽干5min，最后用5mL甲醇(41)洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中。Z1)Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品
10、。GBT 22990-2008将收集的洗脱液通过羧酸型阳离子交换柱(418)，待洗脱液全部流出后，用5 mL甲醇(41)洗柱，减压抽干，用4 mL 001 molL草酸一乙腈溶液(413)洗脱，收集洗脱液于10 mL样品管中，45氮气吹至15 mL左右，流动相定容至2 mL，供液相色谱一紫外检测器测定。73测定条件731液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：Kromasil 1005C”5pm，150 minx46 ram(内径)或相当者；b)流动相：001 molL草酸溶液一乙腈一甲醇(77+18+5)；c)流速：10 mLmin；d)柱温：40；e)检测波长：350 n“；f
11、)进样量：60 pL。732液相色谱测定将混合标准工作溶液(416)分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作衄线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间分别为309 rain、373 rain、827 rain和1253 rain。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图参见附录A中的图A】。74平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。75空白试验除不称取试样外，按以上步骤同时完成空白试验。76回收率试验向阴性试样中添加标准溶液，
12、均按上述步骤操作，测定后计算试样中添加的回收率。添加浓度及回收率范围参见附录B中的表B1。8结果计算被测物残留量的测定按式(1)计算：x。一暑鬻 式中：x。试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(ggkg)；Ci从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度；单位为纳克每毫升(ngmL)；v样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r
13、，牛奶和奶粉中土霉素、3GBT 22990-2008四环素、金霉素、强力霉素添加浓度范围及重复性方程见表1和表2。表1 牛奶中四环素族抗生素添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R土霉素 550 Jg r=O8s】培柳0812 IgR=0899培研一O574四环素 550 lg r一106 lg仇100 lgR一100 lg0 612金霉素 10100 lg r-108 Ig m115 lgR一081 9 lgm 0430强力霉素 10100 lg r一0963 lg m0903 lg R-0838 lg m一0465注：优为两次测定结
14、果的算术平均值。表2 奶粉中四环素族抗生素添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R土霉素 25250 19 r一0872lgm0791 lgR一0 834lg m-u0 500四环素 25250 lgt-m099619m107 19 R-0877 19 m一0542金霉素 50500 lg r一0997 lgm一112 lgR一112lg1 04强力霉素 50500 lg r=0817lgm0738 lgR一0860 lg0 464注：仉为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93
15、再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的添加浓度范围及再现性方程见表1和表2。附录A(资料性附录)标准物质液相色谱国土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图，见图A1。GBT 22990-2008图A1 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图train拍拍加=2加oo喃加坫lGBT 22990-2008附录B(资料性附录)回收率本方法中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其回收率范围试验数据，见表B1。表B1 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其回收率范围试验数据牛奶 奶粉化合物名
16、称添加浓度(pgkg) 回收率范围 添加浓度(pgkg) 回收率5 713876 25 71998 710 8l-2946 50 765900土霉素25 770984 125 80595150 801938 250 81 49925 637743 25 71984 810 713846 50 70389 5四环素25 702803 125 80 293650 70o863 250 81892910 717857 50 71584320 706883 100 814908金霉素50 725899 2j0 805929100 80390 9 500 82890710 711857 50 72693620 708905 100 802891强力霉素50 740885 250 828945100 821948 500 814907
