1、lCs 67050X 04 a圄中华人民共和国国家标准GBT 22993-2008牛奶和奶粉中八种镇定剂残留量的测定2008-12-31发布液相色谱一串联质谱法Determination of eight tranquillizers residuesin bovine milk and milk powder-LCMSMS method200905-0 1实施丰瞀徽紫瓣警矬瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会促19刖 吾GBT 22993-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中
2、华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：宋文斌、李一尘、李军、隋凯、董振霖、李百舸、王旭、赵守成、庞国芳。牛奶和奶粉中八种镇定剂残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22993-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中乙酰丙嗪(cetopromaizine)、氯丙嗪(chlorpromazin)、氟哌啶醇(haloperid01)、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪(propionylpromazine)、甲苯噻嗪(xylazine)、阿扎哌隆(azaperone)及其代谢物阿扎哌醇(azaper01)和p_阻断剂咔唑心安(carazoloD残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和
3、奶粉中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安残留量的测定。本标准方法检出限：牛奶中乙酰丙嗪、氯丙嗪、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、咔唑心安均为05 pgL，甲苯噻嗪为O25 pgL，阿扎哌隆为02 t-gL，阿扎哌醇为015 pgL，氟哌啶醇为o1 bLgL，奶粉中乙酰丙嗪、氯丙嗪、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、咔唑心安均为40 pgkg，甲苯噻嗪为20 pgkg，阿扎哌隆为16 pgkg，阿扎哌醇为12 pgkg，氟哌啶醇为o8 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误
4、的内容)或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，IS0 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理
5、样品在碱性条件下用特丁基甲醚提取，提取液用磷酸盐缓冲液调成酸性，弃去有机相，水相再调成碱性用特丁基甲醚净反萃后浓缩定容，进行液相色谱一串联质谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41乙腈：色谱纯。42甲醇：色谱纯。43无水乙醇：色谱纯。44盐酸：优级纯。45特丁基甲醚。46氢氧化钠。47氢氧化钠溶液：5 moIL。称取500 g氢氧化钠(46)用水溶解，定容到250 mL。48磷酸二氢钾。49磷酸二氢钾溶液：1 molL，pH一30，称取68045 g磷酸二氢钾(48)用水溶解，用盐酸(44)将1GBT 22993-2008溶液的
6、pH值调至30，定容到500 mL。410甲酸铵。411甲酸：色谱纯。412甲酸铵缓冲液：01 molL，pH一40，称取6306 g甲酸铵(410)用水溶解，用甲酸(411)将pH值调至40，定容至1 000 mL。413甲酸铵缓冲液：001 molL，pH一40，取甲酸铵缓冲液(412)100 mL用水稀释定容到1 000 mL。414流动相A：001 molL甲酸铵缓冲液，pH一40(413)，通过02 tLm过滤器过滤。415流动相B：乙腈(41)通过02 pm过滤器过滤。416流动相C：甲醇(42)通过02 pm过滤器过滤。417混合流动相：将70mL流动相A，15mL流动相B以及1
7、5mL流动相c混合。418镇定剂及其代谢物和p阻断剂的标准物质：乙酰丙嗪马来酸，纯度大于等于99；阿扎哌隆，纯度大于等于99；咔唑心安，纯度：99；氯丙嗪盐酸，纯度：99；氟哌啶醇，纯度大于等于99；丙酰二甲氨基丙吩噻嗪盐酸，纯度：98；甲苯噻嗪盐酸，纯度：99；阿扎哌醇，浓度100*gmL(甲醇)。419八种镇定剂标准储备溶液4191 乙酰丙嗪、阿扎哌隆、咔唑心安、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪标准储备溶液：010 mgmL。称取适量的上述标准物质(418)，分别用无水乙醇(43)，配成010 mgmL的标准储备液。储备液避光在24条件下贮存。每年配制一次。4192阿扎哌醇
8、标准储备溶液：10 tugmL。准确移取1OraL阿扎哌醇标准液(418)于10mL容量瓶中，用无水乙醇(43)定容至刻度，混匀，配成10#gmL的标准储备液。储备液避光在24条件下贮存。每年配制一次。420八种镇定剂混合标准储备溶液：量取适量的6种镇定剂及其代谢物标准储备溶液(4191和4192)，用乙腈配制成混合标准储备溶液。在24条件下贮存。421八种镇定剂混合标准工作溶液：根据每种镇定剂及其代谢物的灵敏度和仪器线性范围用空白样品提取液配成不同浓度的混合标准工作溶液。在24条件下避光贮存。注：称取标准物的质量是按纯度和含盐量修正过的质量。5仪器51 液相色谱一串联四极杆质谱仪：配有电喷雾
9、的离子源。52电子天平：感量01 mg和01 g。53离心机：最大转速为10 000 rrain。54离心管：锥形底玻璃离心管，15 mL和10 mL具塞；锥形底聚丙烯离心管，50 mL，具螺旋盖。55过滤器：聚四氟乙烯过滤器，02 pm13 113m；尼龙薄膜过滤器，02 pm47 mm。56液体分配器：1 mL10 mL和5 mL50 mL。57微量移吸器：10L100 pL和i00 pL1 000 pL。58流动相过滤装置。59氮气浓缩仪。510高速涡流混合器。511振荡器。512一次性移液管。513酸度计：测量精度为土002。514超声波仪。2GBT 22993-2008515一次性注
10、射器：1 mL。516试样瓶：20 mL。6试样的制备与保存61试样的制备将牛奶和奶粉样品分别混合均匀。各自分出05 kg作为试样，将分出的试样密封，并作上标记。62试样保存将试样置于4条件下贮存。7测定步骤71提取711牛奶样品称取牛奶试样2Oo mL精确到001 mL，放人50 mL聚丙烯离心管中，加入200 pL乙腈进行涡流混合，混合后加入400 pL 5 molL氢氧化钠溶液，并进行涡流混合30 s。在80土5水浴中放置1 h。在此期间，要对每个测定样品进行两次涡流混合。1 h后，将样品从水浴中取出并冷却至室温。加入12 mL特丁基甲醚，置于振荡器上高速振荡15 rain，离心15 m
11、in(转速为5 000 rrain)。吸出上清液，将特丁基甲醚定量转移到干净的15 mL的玻璃离心管内，待净化。712奶粉样品称取奶粉样品025 g(精确到001 g)，放人50 mL聚丙烯离心管中，加入175 g水超声溶解得到复原乳，加入200 pL乙腈，以下步骤同711。72净化在上述15 mL离心管中加入1 molL磷酸二氢钾溶液(pH一3o)3 mL，振荡10 rain，离心10 rain(5 000 rmin)。将特丁基甲醚层吸出弃去。在磷酸盐溶液中加入2 mL特丁基甲醚，振荡5 min，离心5 min(5 000 rrain)，吸出特丁基甲醚层弃去。然后再在磷酸盐缓冲溶液中加入2
12、mL特丁基甲醚重复上述步骤。加入1 mL 5 molL氢氧化钠溶液摇匀后加入10 mL特丁基甲醚，振荡15 rain，离心5 min(5 000 rrain)。定量吸取特丁基甲醚转移到一个干净的lO mL的离心管中。在40条件下用氮吹仪蒸发至干。在浓缩至干的提取物中加入1 000 pL流动相溶液(417)，进行涡流混合，超声处理10 rain。用02zm13 mm的聚四氟乙烯注射式过滤器过滤样液，将样液转移到试样瓶中，供液相色谱一串联质谱测定。73色谱测定731液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：Inertsil ODS-3，5 pm，150 mm21 mm(内径)或相当者；b
13、)柱温：35；c) 进样量：20 pL；d)色谱柱总流量：200 pLmin；e)流动相及梯度见表1。表1流动相及梯度步 骤 运行时间rain 流动相A 流动相B蹦 流动相C0 000 70 15 151 400 70 15 152 900 40 15 45GBT 22993-2008表1(续)步 骤 运行时间min 流动相A 流动相B 流动相C3 2500 35 1 5 504 2800 20 80 505 3000 70 15 156 6000 70 15 15732质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应检测(MRM)；d)
14、电喷雾电压(Is)：5 000 V；e) 雾化气压力(CASI)：4826 kPa；f)气帘气压力(cuR)：689 kPa；g)辅助气压力(CAS2)：4826kPa；h) 离子源温度(TEM)：700；i)接口加热50 20K50 10K20 K10允许的最大偏差 士20 士25 士30 士507332定量测定用混合标准溶液(421)分别进样，以峰面积为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中镇定剂及其代谢产物和p阻断剂的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述的色谱条件和质谱条件下，八种镇定剂的参考保留时间见表4。八种镇定剂的标准物质总离子
15、流图参见附录A中的图Ai。八种镇定剂的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1、表B2。表4八种镇定剂参考保留时间化合物名称 保留时间rain 化合物名称 保留时间rain甲苯噻嗪 512 氟哌啶醇 15 90阿扎哌醇 921 乙酰丙嗪 16 56咔唑心安 11 38 丙酰二甲氨基丙吩噻嗪 1884阿扎哌隆 130l 氯丙嗪 197474平行试验按照以上步骤，对同一试样进行平行试验。75回收率试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。8结果计算试样中每种镇定剂及其代谢物和p一阻断剂残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：xc筹揣 (1)式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克
16、(pgkg)；c从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；v样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性限和再现性限的值是以95的可信度来计算。GBT 22993200892重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，牛奶和奶粉中六种镇定剂及其代谢物的添加浓度范围及重复性方程见表5。表5牛奶和奶粉中八种镇定剂的添加浓度范围及重复性限和再现性限方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓
17、度范围 重复性限r 再现性限R乙酰丙嗪 o504oo lg r=0749 lg仉一1113 lg R一0662lgm+0436氧丙囔 050400 lg r=0597 1 Ig优1066 3 IgR-O768 2lgm+0435 5氟哌啶醇 010080 lg T-O971 53lgm一1393 65 IgR一0922 56 Igm+0447 11丙酰二甲氨基丙吩噻嗪 050400 lg r一1018 8 lgm一1432 3 lgR一1591 6 lgm+2207 5甲苯噻嚷 025200 lg F-2444 83918 7 lgm lgR-3 436 5+6085 9 lgm阿扎哌隆 02
18、0160 lg F-0670 6 lgm 0109 5 lgR-0699 7lgm+O354 6阿扎哌醇 015120 19 r一1034 79lgm一1099 9 lgR一1106 lgm一2131 2咔唑心安 050400 lg F-0372 6 lgm 0630 2 lgR-0 462 2lgm+04401注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，牛奶和奶粉中六种镇定剂及其代谢物的添加浓度范围及再现性方程见表5。附录A(资料性附录)标准物质总离子流图八种
19、镇定剂标准物质总离子流图，见图A19 2e59 0e58 5e58 0e57 5e57 0e565e56 0e55 5e55，0e54 5e54 0e53 5e53 Oe52 5e52 0e51 5e51 Oe55 Oe4GBT 22993-2008甲苯噻嗪512 min，阿扎哌醇921 rain，咔唑心安 1138 min。阿扎哌隆1301 rain，氟哌啶醇1590 rain，乙酰丙嗪1656 min丙酰二甲氨基丙吩噻嗪1884 rain，氯丙嚷1974 min图A1八种镇定剂标准物质总离子流图7GBT 22993-2008附录B(资料性附录)回收率八种镇定剂添加浓度及其平均试验数据，见表
20、B1、表B2。表B1 牛奶中八种镇定剂添加浓度及其平均试验数据化合物名称 添加浓度(pgL) 平均回收率050 8810100 8920乙酰丙臻2 00 8993400 9194o50 89611 00 8629氯丙嗪200 8939400 9029o10 876(3o20 8928氟哌啶醇040 8690O80 9072050 8852100 91 39丙酰二甲氨基丙吩噻囔2 oo 92374 oo 90380 2j 8990050 9138甲苯噻嗪1oo 9212200 9059020 8935o 400 8815阿扎哌隆080 9007l_60 9026015 9144030 9145阿
21、扎哌醇060 871II20 8742050 8972100 8858咔唑心安200 9249400 90398表B2奶粉中八种镇定剂添加浓度及其平均回收率试验数据GBT 22993-2008化合物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率40 92858O 9168乙酰丙嗪1Z0 903016O 941340 907180 8368氯丙嗪12O 841116O 886108 887916 9352氟哌啶醇24 88023 2 87 914 0 92188 0 9041丙酰二甲氨基丙吩噻嚷12 O 8724160 875420 906240 8698甲苯噻嗪6 0 875280 815916 908032 8589阿扎哌隆48 860564 946512 851524 8998阿扎嚷醇36 933648 974540 92878 0 9100咔唑心安120 8804160 9172
