1、ICS 67050X 04 圆酋中华人民共和国国家标准GBT 22994-2008牛奶和奶粉中左旋咪唑残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of levamisole residues in milk and milk powderLCMSMS method2008-12-31发布 2009-05-0 1实施宰瞀粥鬻瓣警箍警瞥篓发布中国国家标准化管理委员会捉11刖 昌GBT 22994-2008本标准附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归1：3。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国青海出入境检验检
2、疫局。本标准主要起草人：薄海波、雒丽丽、贾光群、曹彦忠、赵青、庞国芳。牛奶和奶粉中左旋咪唑残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22994-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中左旋咪唑残留量液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于液态奶(包括原料奶、纯牛奶、脱脂牛奶)和奶粉(包括纯奶粉、脱脂奶粉和婴幼儿配方奶粉)中左旋眯唑(1evamisole)残留量的测定。本标准牛奶中左旋咪唑检出限为04 pgkg；奶粉中左旋眯唑检出限为32 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准
3、，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GBT 6379t2004，ISO 5725 1：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理在碱性环境下用乙酸乙酯提取试样中的左旋眯
4、唑残留，用稀盐酸将提取液中左旋咪唑转化为盐酸左旋咪唑并反提到盐酸层，强阳离子交换固相萃取柱净化，液相色谱一串联质谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。41水：GBT 6682，一级。42乙酸乙酯：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44甲醇：色谱纯。45氢氧化钠。46浓盐酸。47氨水。48氯化钠。49无水硫酸钠：用前在650灼烧4 h，置于干燥器中冷却后备用。410甲酸：优级纯。411 01甲酸溶液：取1 mL甲酸，用水定容至1 000 mL。当天配制。412 02 molL盐酸溶液：取18 mL盐酸(46)，用水定容至l 000 mL。413 10 molL氢氧化钠溶液：
5、称取40 g氢氧化钠(45)，用水溶解并定容至100 mL。414氨水一甲醇溶液(1+3)：量取50mL氨水(47)与150mL甲醇(44)混合，摇匀。】GBT 22994-2008415盐酸左旋咪唑标准品(1evamisole hydrochloride，CAS：1659580一5)：纯度98。416标准储备溶液：准确称取适量的标准品，用甲醇(44)溶解、转移至50 mL棕色容量瓶中并定容至刻度。该溶液浓度为1 mgmL。储备液贮存在一18冰柜中，有效期为半年。417标准中间溶液：吸取100 mL标准储备溶液(416)，移人100 mL棕色容量瓶，用水定容，该溶液浓度为10 pgmL。04冰
6、箱保存。418标准工作溶液：根据需要吸取适量标准中间溶液(417)，用流动相稀释至所需浓度，使用前配制。419强阳离子交换固相萃取柱或相当者：3 mL，500 mg。使用前依次用甲醇3 mL、水3 rrlL和02 molmL盐酸1 mL活化，保持柱体湿润。420滤膜：02 pm。5仪器和设备51 液相色谱一串联质谱联用仪：配有电喷雾离子源(ESI)。52固相萃取净化装置。53分析天平：感量01 mg，001 g。54旋涡混匀器。55超声波清洗器。56离心机：带有50 mL螺口聚丙烯离心管。57移液器：1 mL，2 mL。58氮气吹干仪。59样品瓶：2 mL。6试样制备与保存61试样的制备从全部
7、样品中取出有代表性样品约1 kg，充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封后作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。62试样的保存将试样于4保存。7测定步骤71提取711牛奶样品称取10 g混匀的试样(精确至001 g)于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 molmL氢氧化钠01 mL、氯化钠(48)约5 g和乙酸乙酯(42)20 mL，涡旋混匀1 rain，振荡10 min，以4 000 rmin离心10 min。取上层乙酸乙酯10 mL于另一个50 mL聚丙烯离心管中，加02 molL盐酸20 mL，振荡10 rain，以2 000 r
8、min离心5 rain。取下层盐酸溶液10 mL，待净化。712奶粉样品称取125 g奶粉于烧杯中，加适量35-50水将其溶解，待冷却至室温后，用水定容至100mL，充分混匀。量取10mL溶液于50mL聚丙烯离心管中，按711步骤提取。72净化将71所得的提取液10mL加载到SCX小柱，依次用水3mL、02molL盐酸1mL和甲醇3mL淋洗，用氨水甲醇溶液(414)40 mL洗脱。用氮气吹干仪将洗脱液吹干，用流动相定容至1 mL，过02 gm滤膜。供液相色谱一串联质谱测定。273测定条件731液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：BEH C1s，17 pm，50 mmX 21 ra
9、m(内径)或相当者b)流动相：乙腈01甲酸溶液(3+17)；c)流速025 mLmin；d)柱温：35；e)进样量：50“L。732质谱参考条件质谱参考条件如下：a)电离模式：ESI+；b)检测方式：多反应监测(MRM)；c)毛细管电压：25 kV；d)离子源温度：1lo；e)去溶剂气温度：380；f) 去溶剂气(氮气)流量：600 Lh；g)锥7L气(氮气)流量(N。)：40 Lh；h)碰撞气(氩气)流量：0，1 Lh；i) 定性离子对、定量离子对和碰撞能量等参数见表1。表1 定量离子对、定性离子对和碰撞能量等参数GBT 22994-2008定性离子对 定量离子对 碰撞能量 驻留时间 锥孔电
10、压化合物中文名称化合物英文名称(mz) (仇2) V v20592 38 300 40左旋昧唑 levamsole 20592205179 20 300 4074测定741定性测定样品溶液按照液相色谱一串联质谱分析条件进行测定时，如果检出的色谱峰保留时间与标准溶液中左旋咪唑的保留时间偏差在25之内，在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的两对定性对均出现，而且离子对丰度比与浓度接近的标准溶液谱图中离子相对丰度比偏差不超过规定的范围(见表2)，则可以判断样品中存在左旋眯唑。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许最大偏差 士20 25 土3
11、0 士50742定量测定用混合标准工作溶液(418)进样，以工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。待测样液等体积进样测定。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中左旋眯唑的响应值应在检测的线性范围内。在上述液相色谱一串联质谱分析条件下，左旋咪唑的参考保留时间约为12 min。左旋咪唑标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中圉A1。左旋咪唑的添加浓度和回收率实验数据参见附录B中的表B1。75平行试验按以上步骤对同一试样进行平行试验测定。3GBT 22994-200876空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行测定。8结果计算左旋咪唑残留量的测定按式(1)计算x=c筹揣式中
12、：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)V样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，试样中左旋咪唑添加浓度范围及重复性方程见表3。表3左旋咪唑含量范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限， 再现性限
13、Ro4-20左旋咪唑 19 r-1 133 9Igm一0568 0 lgR-1 579 1 lgm 0888 23Z160注：m为两次测定结果的平均值。如果两次测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，试样中左旋咪唑添加浓度范围及再现性方程见表3。附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图左旋咪唑标准物质多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。响应值1001 00 train图A1 左旋咪唑标准物质多反应监测(MRM)色谱图GBT 22994-2008GBT 22994-2008附录B(资料性附录)回收率左旋咪唑的添加浓度和平均回收率试验数据，见表B1。表B1 左旋咪唑的添加浓度和平均回收率试验数据样品基质 添加浓度(pgkg) 平均回收率20 78210 805牛奶20 86 o100 89 150 87 310 835奶粉20 885100 934
