1、ICS 65140B 47 a雪中华人民共和国国家标准GBT 23 1 962008蜂胶中阿魏酸含量的测定方法液相色谱一紫外检测法Determination of ferulic acid content in propolis-HPLC-UV method2008-12-31发布 200906-0 1实施宰瞀徽鬻瓣警麟瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅1”刖 昌GBT 23196-2008本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录。本标准由中华全国供销合作总社提出并归口。本标准起草单位：杭州澳医保灵药业有限公司、中华全国供销合作总社蜜蜂产品标准化技术委员会、中国农业科学院蜜蜂研究所、江苏出入
2、境检验检疫局、南京大学、江苏老山生物科技有限公司。本标准主要起草人：虞英民、胡晓岚、朱金梁、徐承智、周金慧、李公海、陈坤、练鸿振。蜂胶中阿魏酸含量的测定方法液相色谱一紫外检测法1范围本标准规定了蜂胶中阿魏酸含量的液相色谱测定方法。本标准适用于蜂胶中阿魏酸含量的测定。本标准的检出限：4tgkg。2规范性引用文件GBT 231962008下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6
3、682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理蜂胶中的阿魏酸经甲醇超声提取、沉淀、离心，再用045 pm滤膜过滤后得澄清液，经反相色谱柱分离后，用液相色谱一紫外检测器测定，外标法定量，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。4试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯；水为GBT 6682规定的一级水(为蒸馏水或同等纯度水)；未指明用何种溶剂配制时，均指水溶液。41甲醇：色谱纯。42 0085磷酸溶液(体积分数)：量取o85 mL磷酸，用水定容至l 000 mL，经045 pm滤膜过滤。43乙腈：色谱纯。44 70甲醇(体积分数)：量取7
4、0mL分析纯甲醇，加30mL水混合均匀。45阿魏酸标准物质：纯度99。46阿魏酸标准储备溶液(2000tgmL)：准确称取100mg(精确到01 mg)阿魏酸标准物质(45)于50 mL棕色容量瓶中，加70甲醇(44)使其溶解并定容至刻度，混匀，此溶液可在温度低于4冰箱中冷藏保存两个月。47阿魏酸标准工作溶液：分别吸取适量的阿魏酸标准储备溶液(46)1 mL、25 mL、50 mL、100 mL、200 mL、400 mL、800 mL至100 mL容量瓶中，用70甲醇(44)定容至刻度，配成2019mL、50LgmL、100 btgmL、200 tlgmL、40019mL、800 btgmL
5、、1600 pgmL标准工作溶液，现配现用。5仪器与设备51液相色谱仪：配有紫外检测器。52分析天平：精确至01 mg。53过滤膜(聚偏氟乙烯微孔滤膜F型，425 mm)：045 pm。54超声仪。】GBT 23 196200855离心机。56匀浆仪。6试样的制备与保存61试样的制备从全部蜂胶样品中取出约100 g样品，装入洁净容器中分成两份，密封，并做标记。62试样的保存将试样于一10以下保存。7测定步骤71试样处理将试样置冰柜中一10以下冷冻，取出冷冻贮存的试样20 g30 g，迅速用匀浆仪打碎，称取试样05 g(精确到01 mg)，置于50 mL棕色容量瓶中，加入35 mL甲醇(41)，
6、超声15 min(频率为25 kHz，功率为50 w)，加入10 mL水，摇匀，冷却到室温后，用水定容至刻度，混匀；以4 500 rmin的转速离心20 min，上清液用045 tim滤膜(53)过滤，滤液用于液相色谱仪紫外检测器测定。72色谱测定721液相色谱条件a)色谱柱：Hypersil ODS2，5 pm，46 mm200 mm。b)流动相：以0085磷酸溶液(42)为流动相A，以甲醇(4。1)为流动相B，以乙腈(43)为流动相C，按表1进行梯度洗脱。表1梯度洗脱方法时间min 流速(mLmin) 0085磷酸溶液(流动相A) 甲醇(流动相B) 乙腈(流动相c)020 10 83 O
7、172021 1O，l 5 83-O O-100 17-02136 15 O 100 03637 15 0，83 100，0 0173752 15 83 0 17c)梯度洗脱方法：见表1。d)进样量：20 pL。e)检测波长：316 rim。f)柱温：30。722液相色谱测定测定5个7个系列浓度标准工作溶液(47)在上述色谱条件下的峰面积，以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线，然后测定未知样品，用标准工作曲线对样品进行定量，使样品溶液中阿魏酸的响应值在本法的线性范围内。在上述色谱条件下，阿魏酸的保留时间约为139min，阿魏酸标准物质色谱图和含有阿魏酸的蜂胶样品色谱图参见图A1、图A2。73平行
8、试验按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。74空白试验除不称取试样外，均按上述步骤，应不干扰测定。28结果计算试样中阿魏酸含量利用数据处理系统计算或按式(1)计算x一生塑 m式中：x试样中阿魏酸的含量，单位为微克每克(pgg)；c试样中阿魏酸的浓度，单位为微克每毫升(,ugmL)50试样定容体积(mL)；m试样的质量，单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。9精密度GBT 23 1 962008在对同一试样进行二次平行试验获得的二次测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10。本标准的研究资料参见附录B和附录C。GBT 23196-2008附录A(资料性附录)标准物质色谱图和含有阿魏酸的蜂胶
9、样品色谱图A1 阿魏酸标准物质色谱图，见图A1。555。454035l 30暮。；20151。5o口。尝鼍NfI】o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 lO j1 12 13 14 15 16 17 18 19 20时间m,n图A1标准物质色谱图A2含有阿魏酸的蜂胶样品色谱图，见图A2。4555。454。35l 300。2。15lO5Oi卧罄J m0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20时闻mm图A2样品色谱图B1线性关系考察：见表B1。附录B(资料性附录)方法学研究资料表B1 含量测定线性关系试验结果(H：7)GBT 2319
10、62008浓度(pgmL) 20 50 100 200 400 800 160 0峰面积 119 334 271 840 542 793 1 059 571 2144 527 438 810 0 8 443 418线性方程 ，=52 976x+25 179 R20999 6B2紫外扫描图：见图B1。遥罄督峰值检测序号 波长rim 吸收值1 31640 042l2 38680 一00033 25880 0104图B1紫外扫描图5GBT 23196-2008附录C(资料性附录)阿魏酸CAS：1135246英文名称：3一(4一hydroxy-3一methoxyphenyl)一2一propenoic acidferulic acid4-hydroxy-3一methoxycinnamic acid3-methoxy-4一hydroxy-cinnamic acid化学名称：3一(4一羟基一3一甲氧基苯基)2一丙烯酸阿魏酸4一羟基一3一甲氧基肉桂酸3一甲氧基一4一羟基肉桂酸相对分子质量：19419分子式：C1。H1。0。结构式：。妙oH111 jO性状描述：有顺反异构体。E型，正方棱状结晶，熔点为174；z型，黄色油状液体，溶于热水、乙醇、乙酸乙酯，乙醚中可溶，石油醚、苯中难溶。6
