1、ICS 67050X 04 囝雷中华人民共和国国家标准GBT 232 1 22008牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定液相色谱一荧光检测法Determination of aflatoxin B1，B2，G1，G2，M1，M2 contentin milk and milk powderHPLC_fluorescence detection method2008-1231发布 2009-05-01实施宰瞀徽鬻瓣警襻瞥叁发布中国国家标准化管理委员会厘111刖 昌GBT 232122008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
2、提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈瑞春、段文仲、吕红英、郭春海、王丹娜、刘凌云、姚春毅、杨秀萍、庞国芳。牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定液相色谱一荧光检测法GBT 2321220081范围本标准规定了牛奶、奶粉中黄曲霉毒素B、B：、G，、G。、M。、M。含量的液相色谱一荧光检测法。本标准适用于牛奶、奶粉中黄曲霉毒素B1、B。、G，、G：、M、M：含量的测定。本标准方法的检出限：牛奶中：黄曲霉毒素B】为0002 pgkg，黄曲霉毒素Bz为0001 pgkg，黄曲霉毒素G。，G：为
3、0003 pgkg，黄曲霉毒素M。、M：为0005 pgkg；奶粉中：黄曲霉毒素B1为002 pgkg，黄曲霉毒素B：为001 pgkg，黄曲霉毒素G。、G：为o03 pgkg，黄曲霉毒索M，、Mz为o05 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GBT 637912004，ISO
4、 57251：1 994，IDT)GBT 6379。2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理试样经溶解、离心、过滤后，当样品通过免疫亲和柱时，黄曲霉毒素特异性抗体选择性地与存在的黄曲霉毒素B，、B：、G。、G。、M、Mz(抗原)键合，形成抗体一抗原复合体。甲醇一乙腈混合溶液洗脱，带荧光检测器的高效液相色谱仪经柱后衍生测定黄曲霉毒素B1、B。、G，、Gz、M。
5、、M。的含量，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42乙腈：色谱纯。43过溴化溴化毗啶。44甲醇一乙腈混合溶液(4+5)：取40 mL甲醇，加入50 mL乙腈，混合均匀。45柱后衍生液：称取005 g过溴化溴化吡啶，溶解于l 000 mL水中，以045 pm的尼龙滤膜过滤，4避光保存。46黄曲霉毒素B，(CAS NO1162658)、B2(CAS NO7220817)、G】(CAS NO1165395)、G：(CAS NO7241987)、M，(CAS NO6795239)、M：(CAS NO688557一O)标准物质：
6、纯度大于等于99。1GBT 23212200847黄曲霉毒素(B-、B：、G。、Gz、M。、Mz)标准储备溶液：将黄曲霉毒素B1、B：、G。、G：、M，、M。标准物质(46)，分别用甲醇配成60 ngmL的标准储备液。储备液于一4保存。48黄曲霉毒素(B1、岛、G。、Gz、M，、Mz)混合标准工作液：根据需要用流动相将黄曲霉毒素B，、B。、Gt、Gz、Mz、Mz稀释成所需浓度的混合标准工作溶液，混合标准工作溶液现用现配。49免疫亲和柱：免疫亲和柱应含有黄曲霉毒素Bt、B2、G。、G。、M。、M。的抗体。亲和柱的最大容量不小于100 ng黄曲霉毒素B，、BtG G：、M。、M：(相当于50mL浓
7、度为2#gL的试样)。410滤膜：045 btm。5仪器和设备51液相色谱仪：配有荧光检测器，带柱后衍生系统。52分析天平：感量01 mg，001 g。53水浴：50土2。54冷冻离心机。55空气压力泵。56旋涡混合器。57玻璃纤维滤纸：孔径15 pm。58塑料离心管：50 mL。59玻璃注射器：10 mL。510玻璃刻度试管：10 mL。6试样的制备与保存61试样的制备将牛奶从冰箱中取出，放置至室温，摇匀，备用。62试样保存牛奶置于04冰箱中避光保存，奶粉常温避光保存。7测定步骤71提取711牛奶称取20 g试样，精确到001 g，置于50 mL的离一t5管中。于10 000 rrain、一
8、5条件下离心10 min，玻璃纤维滤纸过滤，待净化。712奶粉称取2 g试样，精确到001 g，置于50 mL的离心管中。将20 mL已预热到50的水边加边振摇至奶粉完全溶解，旋涡混合器(56)振荡2 rain，混合均匀。如果奶粉不能完全溶解，将离心管在50的水浴(53)上加热，仔细混匀。将奶粉乳浊液冷却至室温后，于10 000 rrain、一5条件下离心10 rain，再用玻璃纤维滤纸过滤，待净化。72净化将71的过滤液全部转移到10 mL玻璃注射器(59)中，调节空气压力泵(55)，控制试样以2 mLmin3 mLmin稳定的流速过柱，直至2 mL3 mL空气通过柱体。向上述注射器内加入1
9、0 mL水，以稳定的流速洗柱，弃去全部流出液，并使2 mL3 mL空气通过柱体。准确加入10 mL甲醇一乙腈混合溶液(44)至上述注射器，以2 mLmin3 mLmin稳定的流速将亲和柱上的黄曲霉毒素B。、B2、G-、Gz、M。、M：洗脱下来，收集全部洗脱液于玻璃刻度试管(510)中，用水定容至2 mL。于旋涡混合器(56)上振荡1 min，过045 pm滤膜(410)。供液相色谱测定。2GBT 23212200873测定条件731液相色谱参考条件a) 色谱柱：Inertsil ODS-3，5“m，250 mm46 ram(内径)或相当者；b)流动相：水+甲醇+乙腈(11+4+5)；c)流速：
10、流动相：l，0 mLmin，柱后衍生液：045 mLmin，柱后衍生反应器温度：35；d)柱温：35；e)检测波长：激发波长：355 nm，发射波长：430 nm；f)进样量：100zL。732液相色谱测定根据样液中黄曲霉毒素B1、B：、G，、G。、M。、M。的含量情况，选定浓度相近的混合标准工作液，混合标准工作液中黄曲霉毒素B。、B。、G。、G：、M。、M。的响应值应在仪器检测的线性范围内。对混合标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，黄曲霉毒索B，、B。、G。、G。、M。、M。参考保留时间分别为71 min、80 min、92 min、106 min、114 min、133
11、rain。黄曲霉毒素B1、B2、Gl、Gz、M1、M：标准物质液相色谱图参见图A1。74平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。75空白试验除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。76回收率试验向阴性试样中添加标准溶液，均按上述步骤操作，测定后计算试样中添加的回收率。添加浓度及回收率范围参见表B1。8结果计算每种黄曲霉毒素含量的测定按式(1)计算：X。筹揣式中：x。 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(-gkg)；Ci从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)v 样品溶液定容体积，单位为毫升(raL)；m 样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。i
12、表示第i种黄曲霉毒素，计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B，、Bz、G-、Gz、M，、M。添加浓度范围及重复性方程见表1和表z。3GBT 232122008表1 添加浓度范固及重复性和再现性方程(牛奶) 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R黄曲霉毒素B1 o002002 r一0082 8m+0135 6 R一0284 Om一0149 4黄曲霉毒
13、素B2 0001001 r=0070 6m+0049 9 R一0226 6m+0034黄曲霉毒紊G， 0003003 r；0264 9m一0459 3 R一0404 1m一0 328 8黄曲霉毒素G2 0003O03 r一0264 2m一0370 5 R一0 342 4m一0305 6黄曲霉毒素M。 0005005 r一0136 4m+0034 7 R一0325 1优一0080 8黄曲霉毒素Mz 0005005 r一0219 6m一0501 6 R一0419 8m+0269 9注：m为两次测定结果的算术平均值。表2 添加浓度范围及重复性和再现性方程(奶粉) 单位为微克每千克化合物名称 掭加浓度
14、范围 重复性限r 再现性限R黄曲霉毒素B， 00202 r一0084 lm+0218 7 R一0192 9m+1094 4黄曲霉毒素B2 00101 r一0151 5m 0155 8 R一0284 0m一0464 2黄曲霉毒素G， 00303 r一0131 6m+0075 8 R=0153 6m+1509 4黄曲霉毒素岛 00303 r一0132 6m+0457 2 R一0185 8m+0732 9黄曲霉毒素M。 00505 r一0150 7m一0587 9 R一0246 lm+2496 4黄曲霉毒素Mz 00505 7-_0159 0m一3647 6 R一0327 47 669 5注：m为两
15、次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、Bz、G。、Gz、M-、Mz添加浓度范围及再现性方程见表1和表2。4附录A(资料性附录)标准物质色谱图黄曲霉毒素B。、B。、G。、Gz、M-、M。标准物质液相色谱图见图A1。110010009 008 007 006 005 004 003 002 001 00GBT 2321220080 00 4 00 8 001黄曲霉毒素Mz；2黄曲霉毒素M，；3黄曲霉毒素Gz；4黄曲霉毒素Gt；5黄曲霉毒素B
16、2；6黄曲霉毒素B。图A1 黄曲霉毒素B，、B2、G、Gz、M，、M：标准物质液相色谱图1400zrain5GBT 232122008驸录B(资料性附录)回收率黄曲霉毒素B1、B：、G。、G：、M。、Mz添加浓度及其回收率范围的试验数据见表B1。表B1 黄曲霉毒素B，、B：、G，、G2、M，、M：添加浓度及其回收率范围的试验数据牛 奶 奶 粉化合物名称添加浓度(,gkg) 回收率范围 舔加浓度(tlgkg) 回收率范围0002 550710 002 5186750004 615675 004 533698黄曲霉毒素B，0010 570761 010 5896850 020 61 0785 02
17、0 58 57200001 627755 010 5427850002 635835 0 20 615770黄曲霉毒素B2O005 604878 050 60 68000010 715861 0 10 5988060003 690967 003 5637200006 620815 006 733850黄曲霉毒素G。0015 647953 015 6537600030 630100 030 7308670003 713983 003 7109670006 79 2913 006 815965黄曲霉毒素G：0015 753960 015 8339330030 743102 030 7709470 005 588836 005 6848680010 701975 010 665901黄曲霉毒素M。0025 66 8852 025 6008680050 71 8862 050 7249020005 43 0748 050 5106460010 51 3736 010 616723黄曲霉毒素M20025 508748 025 5527280050 540756 O50 580718
