1、ICS 11. 220 B 41 道雪中华人民共和国国家标准G/T 27518一2011西尼罗病毒病检测方法Diagnostic of west nile virus infections 2011-11-21发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2012-03-01实施发布目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。GB/T 27518-2011 本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、北京百欧赛地生物工程技术开发中心。本标准主要起草
2、人:杨秀娟、孙福军、丁若愚、田茵、田睿、王飞、杨静。I GB/T 27518-2011 西尼罗病毒病检测方法范围本标准规定了西尼罗病毒的反转录聚合酶链反应(ReverseTranscription-Polymerase Chain Re action, RT -PCR)、蚀斑减少中和试验(PlaqueReduction Neutralization Test, PRNT)和西尼罗病毒的分离方法。本标准适用于易感动物的西尼罗病毒病的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)
3、适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 缩略语下列缩略语适用于本文件。ABTS diammoni um2 ,2 -azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) : 2 , 2连氨基-双-(3-乙基苯并二氢哇哇琳-6-磺酸)二镀盐AMV:鸟类成髓细胞白血病病毒(avianmyeloblastosis virus) BSA:牛血清白蛋白(bovineserum albumin) CPE:细胞病变效应(cytopathiceffect) cDNA:互补DNA(complementaryDNA) DEPC:焦碳酸乙二醋(diet
4、hylpyrocarbonate)DNA deoxyribonucleic acid:脱氧核糖核酸dHzO:双蒸水(doubledistilled water) dNTP:脱氧核昔酸三磷酸(deoxy-ri bon ucleoside tri phos pha te)含有dCTP、dGTP、dATP、dTTP四种脱氧核糖核昔EDTA:乙二胶四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) 6-FAM:6-援基荧光素(6-carboxyfluoresccin) HEPES:起乙基呱嗦乙硫磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanc-sulp
5、honicacid)MEM:基础培养基(minimaessential medium) Oligo dT:多聚T再加上一小段随机碱基(几个碱基)构成的引物，用于RT-PCRPBS:磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebelanced solution) PFU:蚀斑形成单位(plaqueforming units) PRNT:蚀斑减少中和试验(plaquereduction neutralization test) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RNasin:核酸酶抑制剂(RNAenzyme inhibitor) TAE:醋酸盐EDTA( tris-acetate-ED
6、T A Tris) 1 GB/T 27518-2011 Taq酶z耐热DNA聚合酶(thermusaquaticus polymerase) TAMRA:四甲基罗丹明(carboxytetramethylrhodamine) TRlzol:一种新型总RNA抽提试剂(trizolreagent) ，可以直接从细胞或组织、中提取总RNAVero细胞:非洲绿猴肾细胞WNV:西尼罗病毒(westnile virus) 4 试剂4. 1 水:符合GB/T6682中一级水的规格，用DEPC处理以除掉RNA酶04.2 TRlzol试剂或其他等效的商品化RNA抽提试剂。4.3 AMV逆转录酶:20U/uL,
7、-20 .C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4. 4 5 X AMV Buffer: AMV逆转录酶的缓冲液。4.5 RNasin:20 U/uL，一20.C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4.6 Oligo(dT) :RT-PCR的号|物。4.7 10XTaq Buffer:Taq酶的缓冲液。4.8 Taq酶:一20.C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4.9 dNTP三磷酸脱氧核糖核昔，含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。4. 10 琼脂糖z电泳级。4. 11 三氯甲:皖:分析纯。4.12 异丙蹲:分析纯，使用前预冷到一20.C。4.13 75%乙醇。4. 14
8、 PBS: 121 c高压15mn后，无菌加入青霉素和链霉素至1000 U/mL. 4.15 TAE:24.2 g Tris碱、5.719冻乙酸、0.5mol/L EDTA(pH8. 0)10 mL，加水定容至100mL，使用前作50倍稀释，用盐酸调节pH值至7.57.8o4.16 WNV标准毒株、WNV阳性对照与WNV阴性对照。4.17 MEM细胞培养基。4.18 Vero细胞。4.19 胎牛血清。4.20 细胞维持液:含2%3%胎牛血清、青霉素和链霉素分别为100U/mL的元菌MEM.4.21 中性红水溶液z中性红粉0.1g，用去离子水定容至100mL, pH7. 4，高压除菌或0.22m
9、滤膜过滤，无菌分装于褐色瓶内，4.C保存备用。4.22 2倍浓度不含中性红MEM液:10倍法度不含酣红的MEM20 mL，胎牛血清4mL，青霉素和链霉素各10000 U(g) ，去离水定容至100mL, O. 22m滤膜过滤，pH7.27. 4 , 4 .C保存备用。4.23 不含中性红的营养琼脂:使用前配制20g/L琼脂糖水浴融化后保持在43.C45 .C，加入等量已加温至43.C 45 .C的2倍浓度不含中性红MEM液，充分混合均匀，保存在43.C 45 .C水浴中备用。4.24 2倍浓度含中性红MEM液:10倍浓度不含酣红的MEM20 mL，胎牛血清4mL，青霉素和链霉素各10000 U
10、(g) ，中性红水溶液6mL，去离子水定容至100mL, O. 22m滤膜过滤，pH7.27. 4 , 4 .C保存备用。4.25 含中性红的营养琼脂:使用前配制20g/L琼脂糖水浴融化后保持在43.C45 .C，加入等量已加温至43.C45 .C的2倍浓度含中性红MEM液，充分混合均匀，保存在43.C45 .C水浴中备用。4.26 0.1%过氧化氢。4.27 BSA:一般是在购置PCR试剂中带的，是在反应时保持酶活性的。不是必须的。不用自己配置。GB/T 27518-2011 也可不加入反应中。4. 28 o. 5 mol/L pH9. 6的碳酸盐缓冲液:碳酸铀0.32g，碳酸氢铀O.586
11、 g，加水溶解，定容至200 mL。4.29 抗马IgM。4.30 5%脱脂奶粉:5g的脱脂奶粉溶于100mL的PBS缓冲液中。4. 31 o. 05 % tween-20:吐温-20。4.32 辣根过氧化物酶结合的抗黄病毒单克隆抗体。4.33 Rnase:RNA酶(RNApolymerase)。5 器材和设备5.1 24孔细胞培养板。5.2 96孔细胞培养板。5.3 二氧化碳培养箱。5.4 普通冰箱和超低温冰箱z规格2.C8.C，一20.C，一80.C。5.5 研磨器/研钵。5.6 离心机(规格15OOOg)。5. 7 荧光RT-PCR检测仪。5.8 PCR仪。5.9 可调移液器。5. 10
12、 电泳仪。5. 11 细胞瓶。5. 12 微型滤器r装有0.22m滤膜，121.C高压15min. 5.13 5%脱脂乳封板。6 WNV的分离6. 1 实验室生物安全要求实验室生物安全要求按照附录A执行。6.2 样本采集疑似死于西尼罗病毒病的动物可考虑采集血液、血清、脑脊液或组织，其中组织样品可优先采取脑组织和神经组织，其次可采集肾、脾和肝组织。进行血样采集时避免使用阻碍PCR反应的肝素，可用抗凝剂EDTA采血。6.3 样本运输与储存血清样本应冷藏，24h内运送至实验室(血清标本可在4.C存放1周，长期保存置一20.C或以下)。其他样本送至实验室后，病毒分离样本应尽快进行接种分离，48h内进行
13、接种的可置于4.C保存，如未能接种应置一70.C或以下保存，避免反复冻融。6.4 样本处理取感染样本送专业实验室检测，样本的储存和运输应保持在低于一70.C中。组织样本取1g2 g在元菌研磨器或研钵中，加5mL10 mL含10%胎牛血清的PBS溶液，磨G/T 27518-2011 碎，冻融2次3次，3OOOg离心10min，上清液用微型滤器过滤后备用。血液样本直接冻融2次3次，用含10%胎牛血清的PBS溶液稀释10倍，3000g离心10min，上清液用微型滤器过滤后备用。脑脊液样本用含10%胎牛血清的PBS溶液稀释5倍10倍，3000g离心10min，上清液用微型滤器过滤后备用。6.5 病毒分
14、离处理好的样本悬液接种至已80%90%满度单层Vero细胞，24孔细胞培养板每孔加O.2 mL 0.3 mL, 100 mL细胞瓶每瓶加1mL2 mL，5%二氧化碳培养箱中370C吸附1h2 h，倾去病理材料悬液，加入细胞维持液，5%二氧化碳培养箱中37oC吸附3d5 d，连续观察细胞病变(CPE)，如出现典型CPE，可用RT-PCR、PRNT进行病原鉴定;盲传3代后如未观察到CPE，判为病毒分离阴性。7 WNV的检测7. 1 引物与荧光探针7. 1. 1 荧光RT-PCRE基因扩增引物与探针引物1:5TCAGCG ATC TCT CCA CCA AAG-3(NT1160)。引物2:5-GGG
15、TCA GCA CGT TTG TCA TTG-3 (NT1229)。TaqMan探针:5-TGCCCG ACC ATG GGA GAA GCT C-3(NT1186) ，5端标记FAM，3端标记TAMRA。7. 1. 2 荧光RT-PCRNSI基因扩增引物与探针引物1:5-GGC AGT TCT GGG TGA AGT CAA-3 (NT3111)。引物2:5-CTCCGA TTG TGA TTG CTT CGT-3(NT3239)。TaqMan探针:5-TGT ACG TGG CCT GAG ACG CAT ACC TTG T-3 (NT3136) , 5端标记FAM，3端标记TAMRA。
16、7. 1. 3 套式RT-PCR外源引物引物1:5-TTGTGT TGG CTC TCT TGG CGT TCT T-3(NT233-257)。引物2:5-CAGCCG ACA GCA CTG GAC ATT CAT A-3(NT616-640)。扩增片段大小:407bpo 7. 1. 4 套式RT-PCR内源引物引物1:5-CAGTGC TGG ATC GAT GGA GAG G-3(NT287-308)。引物2:5-CCGCCG ATT GAT AGC ACT GGT-3(NT370-390)。扩增片段大小:103 bp。7.2 模板RNA提取血清、血液、脑脊液等液体样品直接取200L于1
17、.5 mL离心管中编号备用;组织样品取2g于元菌研钵中磨碎，加入10mL PBS混匀，40C中3000g离心15min，取200L上清于1.5 mL离心管中编号备用。在1.5 mL离心管中加入被检样品、阴性对照、阳性对照各200L，加入TRlzol试剂600L，再加4 G/T 27518-2011 入三氯甲烧200L，混匀，40C中12000g离心15min，取上清加入一200C预冷的异丙醇400L，混匀，40C中12000g离心15min，轻轻倾去上清液，加入75%乙醇600L洗涤，40C中12000g离心15min, 轻轻倾去上清液，室温干燥5min10 min，加入DEPC71.20L溶
18、解RNA，冰上保存备用。提取的RNA最好在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，应放置一700C冰箱。7.3 反转录在PCR管中依次加入5X AMV Buffer 4L、dNTP(各10mmol/L)2L、RNase20 U、Oligo(dT)50 pmol、AMV逆转录酶10U、RNA模板5L、DEPC水至20L，瞬间离心，430C反转录1h后，立即迅速冷却至4oC，瞬间离心，分装，立即用于荧光PCR或套式PCR，或于一800C保存备用。7.4 荧光PCR采用25L反应体系，在PCR毛细管或PCR反应管中依次加入10X Taq Buffer 2.5L、dNTP(各2. 5 mmol/L)
19、 3L、氧化娱(MgClz)(25 mmol/L) 5.5L、引物(7.1. 1或7.1. 2) (20mol/L)各0.5L、TaqMan探针(在荧光PCR引物中已标出)(10mol/L)1L、TaqDNA聚合酶0.25L、BSA(5g/f-lL) 1L、cDNA(逆转录后的产物)5L、dH20至25L。瞬间离心后于定量PCR仪进行PCR扩增。扩增条件:95 c预变性5min后，95c 15 s、60c 1 min，45个循环，每次循环结束后检测每管扩增的荧光值。7.5 套式PCR在PCR管中依次加入10X Taq Buffer 5L、dNTP(各2.5 mmol/L) 4L、氯化镜(MgC
20、12) (25 mmol/L) 4L、外源引物(7.1.3，20mol/L)各O.5L、TaqDNA聚合酶O.25L、cDNA或外源引物扩增产物5L、dH20至50L。瞬间离心后进行PCR扩增。扩增条件:95 oC预变性5min后，94 oC 45 s、56oC 45 s、72oC 1 min，35个循环，720C延伸10mino取15L扩增产物用16g/L琼脂糖电泳观察结果。如果观察到特异性扩增条带，扩增产物用超纯水稀释至100倍1000倍后用，作为内源引物扩增模板，如果未观察到特异性扩增条带，扩增产物直接作为内源引物扩增模板。内游、引物扩增的反应体系配制方法参照外源引物扩增反应体系进行，扩
21、增条件:95oC预变性5min 后，94oC 45 s、58oC 45 s、72oC 1 min，25个循环，72oC延伸5min。取15L扩增产物用20g/L琼脂糖电泳观察结果。7.6 结果判定7.6. 1 荧光PCR阴性对照元Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数)，并且无扩增曲线;阳性对照Ct值应小于30.0，并出现典型扩增曲线。否则，试验结果无效。在试验结果成立的前提下，如果样品的Ct值小于37，且出现典型扩增曲线为阳d性，Ct值3745为可疑，元Ct值且无扩增曲线为阴性。7.6.2 套式PCR阳性对照的PCR产物电泳后，出现一条特异性条带;阴性对照PCR产物电泳
22、后没有条带，试验结果成立;否则，结果不成立。在试验结果成立的前提下，如果样品PCR扩增产物经过电泳检测后，出现特异性目的片段者为阳性;无特异性扩增片段者为阴性。7.6.3 样品结果判定7.6.3.1 样品同时用E基因和NSI基因进行荧光PCR后，结果均为阳性者判定为含有西尼罗病毒核酸。5 GB/T 27518-2011 7.6.3.2 样品同时用E基因和NSI基因进行荧光PCR后，结果均为阴性者判定为不含有西尼罗病毒核酸。7.6.3.3 样品同时用E基因和NSI基因进行荧光PCR后，其中之一结果均为阴性者，用套式PCR再次进行检测，结果为阳性者判定为含有西尼罗病毒核酸，结果为阴性者判定为不含有
23、西尼罗病毒核酸。7.6.4 荧光PCR和套式PCR的外源引物扩增可采用等效的一步法RT-PCR试剂盒进行检测，其操作和结果判定根据试剂盒的说明书进行，但应优化引物和TaqMan探针浓度，确保检测的特异性和灵敏度与本标准的方法等效。7.6.5 应用荧光PCR和套式PCR检测西尼罗病毒核酸结果为阳性者，必要时应对扩增产物进行核酸序列分析验证。8 蚀斑减少中和试验(PRNT)8. 1 操作程序8. 1. 1 病毒培养WNV标准毒株接种至处于对数生长期80%90%满度非洲绿猴肾(Vero)细胞，37oC吸附1h 后，弃去病毒液，加入细胞维持液，5%二氧化碳培养箱中37oC培养3d4 d，待70%80%
24、细胞出现CPE，一20oC冻融2次，分装，一800C冻存备用。8. 1. 2 PFU测定保存病毒用MEM连续10倍稀释，接种子80%90%满度单层Vero细胞的96孔板，每个稀释度接种8孔，100L/孔，同时设8孔细胞对照，每孔加人MEM100L，5%二氧化碳培养箱中37oC孵育1 h2 h，弃去孔内病毒液，加入不含中性红的营养琼脂100L/孔，5%二氧化碳培养箱中37oC培养4.5 d，加入含中性红的营养琼脂100L/孔，5%二氧化碳培养箱中37oC避光培养，12h后观察CPE，计算病毒的PFUo8. 1. 3 蚀斑减少中和试验待检血清、标准阳性血清和标准阴性血清用MEM做连续2倍稀释后，加
25、入等体积50L含有100 PFU的病毒悬液，充分混匀，37oC作用1h后，将血清与病毒混合液接种至80%90%满度单层Vero细胞的96孔板，每个稀释度接种8孔，100L/孔。同时将稀释好的50L中100PFU的病毒悬液做10倍、100倍、1000倍稀释，接种80%90%满度单层Vero细胞的96孔板，每个稀释度接种4孔8孔，100L/孔，作为病毒回归对照。稀释好的50L中100PFU的病毒悬液接种4孔8孔，100L/孔，作为病毒对照。MEM接种4孔8孔，100L/孔，作为细胞对照。所有处理好的细胞于5%二氧化碳培养箱中37oC孵育1h2 h，弃去孔内液体，加入不含中性红的营养琼脂100L/孔
26、，5%二氧化碳培养箱中37oC培养4.5d，加入含中性红的营养琼脂100L/孔，5%二氧化碳培养箱中37oC 避光培养，12h后观察CPE，按Reed-Muench方法计算血清的中和效价。8.2 结果判定8.2.1 回归对照的病毒浓度为每50L30 PFU300 PFU范围内，并且标准阴阳性对照血清的抗体效价在1个滴度误差范围内，试验成立，试验结果成立的条件下方能判定样品的结果，否则，试验结果不成立，查找原因，并重做试验。8.2.2 待检样品中和效价大于等于1: 10者判为阳性。6 G/T 27518-2011 9 IgM捕获ELlSA9. 1 实验步骤0.5 mol/L pH9. 6的碳酸盐
27、缓冲液稀释抗马IgM作为捕获抗体包被平底96孔ELISA板每孔100L;包被板在40C湿盒中孵育过夜。使用前，用含有0.05%吐温-20的0.01M pH7. 2 PBS洗板两次，每孔用200L300L;用PBS新配制的5%脱脂奶粉封板，每孔加300L，并在室温中孵育60 min，孵育后，移去封闭液，并用PBS洗板3次;被检和对照血清用PBS作1: 400稀释(脑脊髓液作1 : 2稀释)，每份样品加双排孔(每份样品共加4个孔)，每孔50L，包括用和样品同样方法制备的对照阳性和阴性血清z盖上板，并在37oC湿盒中孵育75min;移去血清，并用PBS洗板3次;用PBS稀释病毒和正常抗原，加50L病
28、毒抗原到每份被检血清和对照血清一排孔中，并加50L正常抗原到每份被检血清和对照血清的第二排孔中;盖上板，并在4oC湿盒中孵育过夜;移去孔中抗原，并用PBS洗板3次;用PBS稀释辣根过氧化物酶结合的抗黄病毒单克隆抗体，每孔加50L;盖上板，并在37oC孵育60 min;移去结合物，并PBS洗板6次;每孔加50L新配制的ABTS底物和过氧化氢(0.1%)，在室温中孵育30mino 9.2 结果判定在405nm测光密度值，如果含有病毒抗原的被检样品孔的光密度至少是含病毒抗原的阴性血清对照孔的光密度的两倍，并至少是含有对照抗原的被检样品平行试验孔的光密度的两倍，该被检样品被认为是阳性。10 结果判定1
29、0. 1 组织、血、脑脊液或其他体液中分离到西尼罗病毒，说明动物感染了WNVo10.2 组织、血、脑脊液或其他体液中用RT-PCR检测到西尼罗病毒基因，判定为西尼罗病毒RT-PCR检测结果阳性，或判定为西尼罗病毒基因检测结果阳性。说明动物感染了WNV。10.3 IgM捕捉ELISA检测到西尼罗病毒IgM抗体，判定为西尼罗病毒IgM捕捉ELISA结果阳性。说明动物感染了WNV。10.4 IgM捕捉ELISA结果判定为可疑，并用蚀斑减少中和试验检测到西尼罗中和抗体，判定为西尼罗病毒抗体检测结果阳性。说明动物感染了WNV。-FON|-mhNH阁。GB/T 27518-2011 附录A(规范性附录)实
30、验室生物安全要求A.1 PRNT:所有操作在BSL-3实验室中进行，操作人员防护、所有使用物品和废弃物按BSL-3要求进行。A.2 病毒分离z所有操作在BSL-3实验室中进行，操作人员防护、所有使用物品和废弃物按BSL-3要求进行。A.3 PCR:前期所有操作在BSC(生物安全柜)内进行，病毒裂解液加入后可转移至生物安全2级(BSL-2)实验室进行操作。A.4 动物尸体解剖:所有操作在BSL-3实验室中进行，操作人员防护、所有使用物品和废弃物按BSL-3要求进行。A.5 其他有关西尼罗病毒的操作:前期所有操作在BSC内进行，能有效灭活病毒的去垢剂或病毒裂解液加入后，方可转移至BSL-2实验室进
31、行操作。注:BSL-3:生物安全3级实验室，BSL-2:生物安全2级实验室，BSC:生物安全柜。侵权必究9峰书号:1550661-44034 定价:16.00元版权专有GB/T 27518-2011 打印扫期:20121F3月1H F002A 中华人民共和国国家标准西尼罗病毒病检测方法GB/T 27518- 2011 晤中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三星河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销告舍开本880X 1230 1/16 印张O.75 字数16千字2012年2月第一版2012年2月第一次印刷* 15号:155066. 1-41031定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107
