1、ICS 11. 220 B 41 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 27527-20门禽脑脊髓炎诊断技术Diagnostic techniques for avian encephalomyelitis 2011-11-21发布2012-03-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。GB/T 27527-2011 本标准起草单位:内蒙古农业大学、内蒙古动物疫病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心、
2、北京世纪元亨动物防疫技术有限公司、扬州大学、青岛易邦生物工程有限公司。本标准主要起草人z赵振华、赵心力、陈西钊、孙明、王金玲、秦爱建、范根成、李瑞刚、乌日罕。I GB/T 27527-2011 禽脑脊髓炎诊断技术1 范围本标准规定了禽脑脊髓炎诊断技术，包括流行病学、临床症状、组织病理学变化、病毒分离、琼脂免疫扩散试验、中和试验和间接免疫荧光试验。本标准适用于禽脑脊髓炎的诊断、检疫和流行病学调查。2 缩略语下列缩略语适用于本文件。AE(V) :禽脑脊髓炎(病毒)avian encephalomyelitis( vin时AEV-VR:禽脑脊髓炎病毒VanRoekel株(AEV标准株)(avian
3、encephalomyelitis virus-Van Roekel) EIDso:鸡胚半数感染量(egginfectious dose) FITC:异硫氨酸荧光素(fluorescein isothiocyana te) H.E.染色:苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer saline) 3 流行病学除鸡易感AEV外，雄鸡、鹊辑、火鸡和山鸡也可自然感染。无本病史和未经免疫的鸡群一旦感染，雏鸡发病率通常为40%60%、死亡率为10%80%或更高。不同日龄的鸡一年四季均可感染。随日龄的增长，鸡对AEV的抵抗力
4、不断增强。感染鸡的种蛋可以引起后代鸡胚和雏鸡发病(垂直传播);同时，病鸡的分泌物和排泄物可污染环境、饲料和饮水，引起与其接触的易感鸡发病(水平传播)。自然情况下4周龄以内的雏鸡(幼禽)对AEV最易感;实验室情况下，1日龄雏鸡脑内接种AEV强毒5d7 d 后可发病;经胚胎感染的雏鸡出壳后潜伏期1d7 d，口服感染或自然接触一般9dl1 d后发病。4 临床症状自然感染和人工感染雏鸡的临床症状基本一致，初期精神沉郁、嗜睡、易惊、斜视、呈半蹲姿势、头颈偏向一侧、饮水困难，双腿紧缩、叉开或爪蜷缩，以后可出现站立不稳、进行性运动失调、头颈快速震颤等症状，甚者常因瘫痪、衰竭而死亡。成年鸡感染后一般不出现明显
5、症状，有时仅见轻微腹泻，产蛋率下降10%40%和种蛋孵化率降低。5 组织病理学变化5. 1 材料准备5. 1. 1 器材石蜡切片机、染色缸、载玻片、盖玻片、水浴锅、温箱、显微镜等。GB/T 27527-2011 5. 1.2 试剂10%中性福尔马林溶液、酒精、二甲苯、切片石蜡、H.E.染色液、中性树肢等。5.1.3 样晶临床可疑AE病例的大脑、中脑、小脑、延脑和腰荐部脊髓样品。5.2 操作方法分别切取小块(0.5 cm31 cm3)大脑、中脑、小脑、延脑和腰荐部脊髓样品置10%中性福尔马林溶液中固定24h48 h。常规制片、H.E.染色、中性树胶封片、光镜观察。5.3 病理变化5.3. 1 中
6、枢神经系统典型的组织病理学变化为非化服性脑脊髓炎，主要包括大脑、中脑、小脑、延脑和脊髓的变质性变化、血管反应和胶质细胞增生。5.3.2 变质性变化表现为神经细胞变性和神经组织出现小软化灶。变性的神经细胞肿大、淡染或浓缩，有的呈现中央染色质溶解现象。变性严重的神经细胞和局部神经组织可发生坏死、液化，形成小软化灶。5.3.3 血管反应表现为血管出现以淋巴细胞为主的围管性细胞浸润，浸润的细胞在血管周围散在或呈多层围绕，形成管套。5.3.4 肢质锢胞增生表现为增生的胶质细胞可出现在变性神经细胞周围形成卫星现象，或进入坏死的神经细胞中吞噬坏死物形成噬神经原现象。在软化灶处有数量不等的胶质细胞增生和聚集形
7、成胶质小结。5.4 结果判定若5.3.25.3.4同时出现时则为非化服性脑脊髓炎的典型病变，若主要出现5.3.3，而5.3. 2不明显时，可能与免疫反应有关，常见于免疫鸡群。通过流行病学、临床症状和组织病理学变化可对AE做出初步诊断，在初步诊断的基础上，进行病毒分离(见第6章)。6 病毒分离6. 1 材料准备6. 1. 1 器材元菌剪刀、慑子、平皿、烧杯、玻璃瓶、组织研磨器、注射器，孵化器、离心机、高压灭菌器、冰柜、生物安全柜等。6. 1. 2 试剂生理盐水、青霉素、链霉素。6. 1. 3 材料SPF种蛋、SPF雏鸡。2 GB/T 27527-2011 6.1.4 病料(可疑)AE病雏脑组织(
8、以发病早期为好)。6.2 操作方法6.2.1 病料的采集与保存元菌取病雏鸡脑组织后应立即处理(见6.2.2)，若暂时不能处理，可于一70.C冰柜中保存。6.2.2 病料处理将病料元菌称量、研磨，反复冻融3次，用元菌生理盐水溶液作1: 5稀释制成悬液，并加双抗(双抗终浓度为1000 IU/mL青霉素，100g/mL链霉素)。样品经4000 r/min离心10min，取上清液即为自然病雏脑组织病毒液，冻存、备用。6.2.3 雏鸡接种取6.2.2处理好的病毒液，以0.05mL/羽脑内接种1日龄SPF雏鸡，待出现AE症状后采血致死，同上述方法取脑研磨、制备，获得接种病雏脑组织病毒液，冻存、备用。6.2
9、.4 鸡胚接种取6.2.3病毒样本，以0.2mL/胚，经卵黄囊元菌接种6日龄SPF鸡胚，每份样本至少接种5枚胚，于37.C孵化箱内孵育至16日龄收毒、观察鸡胚病变(同时设未接种病料的健康对照组)。收毒时，首先元菌吸取胚液(尿囊液和羊水)，然后观察胚体发育情况;检查胚体、胚脑病变;取胚脑、胃、肠、膜腺称量、研磨、以胚液作1: 5稀释，同6.2.2加入双抗、离心，制成鸡胚组织病毒液，即为AE自然发病雏鸡第1代胚病毒液(AEVEj)。取AEVEj按照本条上述方法再接种6日龄SPF鸡胚卵黄囊、孵化、收毒、检查鸡胚病变、制备第2代胚病毒液(AEVEz)。这样连续传代直至传代鸡胚出现病变时，该代鸡胚病毒液
10、即可作为病毒鉴定用的AE分离毒病毒液。同时可进行病毒某些特性的检测。与健康对照组鸡胚相比，发病鸡胚病变为z胚体活力减弱、发育不良和肌肉萎缩(胚体重减轻)、腿细爪曲或强直，脑萎缩，皮下、脑、胃肠水肿、出血等。病毒分离后，可通过琼脂免疫扩散试验、中和试验和间接免疫荧光试验中的任一种方法进行病毒鉴定(见第7章)。7 AE的确诊和病毒鉴定7. 1 琼脂免疫扩散试验7. 1. 1 器材准备7. 1. 1.1 器材冰箱、天平、90mm直径的平皿、微量加样器、塑料吸头和打孔器(内径4.0mm、孔间距3.0mm的7孔梅花样金属打孔器)。7.1. 1. 2 试剂禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验冻干抗原(1mL/安瓶)
11、、标准阳性血清和阴性血清、氧化铀、优质琼脂粉、pH7.20.01 mol/L PBS(或生理盐水)、蒸馆水和1%硫柳乘溶液(见附录A)。7. 1.1. 3 待检血清元菌翅下静脉采血1mL左右，分离血清，一20.C冰箱保存备用。3 GB/T 27527-2011 7. 1. 1.4 待检抗原6.2.4 AE分离毒抗原和其他待检抗原。7. 1.2 操作步骤7. 1. 2.1 琼脂板制备琼脂板的制备按如下步骤进行:a) 琼脂液配制z称取优质琼脂粉1.0 g，加蒸馆水至100mL。加热溶化后，加入氯化铀18g，充分溶解后，加入1%硫柳柔溶液(终浓度为0.01%)，摇匀。b) 制板z将琼脂液冷却至47C
12、70 C，取洁净、干燥、直径为90mm的灭菌平皿，放置于无菌工作台内，每个平皿加琼脂液18mL，厚度约为3.0mmo凝固后盖严，把平皿倒置放入4oC冰箱中保存备用(保存期2周)。7. 1. 2.2 打孔从冰箱内取出琼脂板，用7孔一组的梅花形打孔器打孔(中间1孔，外周6孔，见图1)，孔径4.0 mm，孔距3.0mmo将孔中的琼脂轻轻挑出或吸出，勿伤及孔边缘或使琼脂层脱离平皿底。山。图1平皿中梅花形7孔一组排列示意图7. 1. 2.3 封底在酒精灯火焰上通过4次6次加热平皿底面，使底部琼脂稍微融化即可。7.1.2.4 抗原稀释向l安瓶抗原内加入PBS(或生理盐水)1mL，待溶解呈均匀混悬液时即为可
13、使用的AE琼扩抗原液。7. 1. 2.5 加样根据需要和具体条件，可分别应用血清样品或抗原样品按以下处理方式进行加样:a) 检验血清加样:结合图2，用微量加样器吸取抗原液加入中央孔，标十的三孔加标准阳性血清，1、2、3孔加被检血清，每孔均应加满，但不能溢出。每加一个被检样品应换一个吸头。moomo 图2加样示意图4 GB/T 27527-2011 b) 检验抗原加样:结合图2.用微量加样器吸取标准抗体溶液(AE标准阳性血清)加入中央孔，标+的三孔加标准抗原液.1、2、3孔加待检抗原液，每孔均应加满，但不能溢出。每加一个被检样品应换一个吸头。7. 1. 2.6 反应加样完毕，室温静置10min.
14、放入22.C26 .C保湿盒内反应，分别在24h、48h和72h观察并记录结果。7. 1. 3 结果判定7. 1.3. 1 检验血清结果判定7.1.3.1.1 判定前提将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，在抗原与标准阳性血清孔之间出现一条清晰、致密的沉淀线，抗原与阴性血清孔之间不出现沉淀线，说明对照成立，可进行结果判定。7. 1. 3.1.2 阳性标准抗原孔与被检血清孔之间形成的沉淀线与阳性对照血清形成的沉淀线弯曲环联，判为阳性(见图3)。一G8(8) 8 88 注2标十孔为标准阳性血清，1、2、3孔被检血清呈阳性。圈3被检血清呈阳性示意图7. 1. 3.1.3 可疑若标准抗原与被检血清孔间不出现
15、沉淀线，而抗原与标准阳性血清孔间的沉淀线在被检血清孔位置微向内侧弯曲者(见图4中的1号子L)，则被检血清判为可疑反应。对该份血清复检，仍为可疑则判为阳性反应。注:标+孔为标准阳性血清，1孔被检血清可疑，2、3孔被检血清阴性。图4被检血清呈可疑示意图5 GB/T 27527-2011 7.1.3.1.4 非特异性反应若标准抗原孔和被检血清孔间的沉淀线粗且浑浊或与抗原孔和标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉并直伸待检血清边缘者，则判为非特异性反应，应重做。若仍出现非特异性反应则判为阴性(如图5所示第3孔)。注:标+孔为标准阳性血清.1、2、3孔被检血清分别为阳性、阴性和非特异性反应。图5被检血清呈非特异
16、性反应示意图7.1.3. 1. 5 阴性标准抗原孔与被检血清孔之间无沉淀线，抗原孔与标准阳性血清孔间沉淀线直伸延到被检血清孔边缘无弯曲者，则判为阴性(见图的。注z标+孔为标准阳性血清.1、2、3孔被检血清为阴性血清。图6被检血清呈阴性示意图7. 1. 3.2 检验抗原结果判定7.1.3.2.1 判定前提将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，在标准抗原与标准阳性血清孔之间出现一条清晰、致密的沉淀线，标准阳性血清孔与阴性抗原孔之间不出现沉淀线，说明对照成立，可进行结果判定。7. 1. 3.2.2 阳性、可疑、非特异性反应和阴性结果的判定原理和方法同7.1. 3. 1。7.2 中和试验7.2. 1 材料准
17、备7.2. 1. 1 仪器孵化器等。6 GB/T 27527-20门7.2. 1. 2 材料SPF鸡胚、AE标准阳性血清、AE阴性血清、PBS(见附录A)。7.2. 1. 3 病毒样品6.2.4收获的待检AE分离毒病毒液。7.2.2 操作方法7.2.2. 1 病毒滴度(EID5o)测定将待检病毒液作10倍系列稀释至10-1lO-B，分装到两列元菌试管中，第一列8管各加入等量AE阴性血清(对照组)，第二列8管各加入等量AE标准阳性血清(试验组)，混匀后置37.C 1 h，然后每管分别卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚各5枚(0.2mL/胚)，继续孵化至16日龄，剖检、记录各组病变鸡胚数(感染发病胚病变判
18、定标准见6.2.的，分别计算两组的E1Dso.7.2.2.2 中和指数计算待检病毒液的中和指数按式(1)计算:式中zX一一中和指数;W一一试验组E1Dso;Y一对照组E1Dso.7.2.3 结果判定X=WjY 中和指数小于10判为阴性，1050为可疑，大于50判为阳性。7.3 间接免擅荧光试验7.3. 1 材料准备7.3. 1. 1 器材荧光显微镜和冰冻切片机。7.3. 1. 2 试剂FITC标记兔抗鸡IgG抗体、标准阳性血清、阴性血清(SPF鸡血清)、元水乙醇和丙酣。7.3. 1. 3 组织样晶AE雏鸡脑组织样品、健康对照雏鸡(阴性)脑组织样品和待检脑组织样品。7.3.2 操作方法7.3.2
19、. 1 冰冻组织切片制备. ( 1 ) 取AE脑组织样品、阴性脑组织样品和待检禽脑组织样品或十二指肠样品，分别霍以冷冻固定剂，一70.C固定过夜。次日，取出，经冰冻切片机切片，将组织切片置载玻片上，用一20.C预冷的丙酣乙醇(3 : 2)固定液室温固定5min10 min。7 GB/T 27527-2011 7.3.2.2 间接免疫荧光检测将固定好的组织切片，PBS洗3次，加上标准阳性血清，SPF鸡血清各100L/块组织，于37.C温育30min后用PBS洗涤3次，加人FITC标记兔抗鸡IgG抗体，置37.C温育30min，经PBS洗涤3次后在荧光显微镜下观察。7.3.3 结果判定7.3.3.
20、 1 判定前提AE脑组织切片与阳性血清作用，出现明亮绿色荧光，而AE脑组织切片与阴性血清作用以及阴性脑组织切片与阳性血清作用均无亮绿色荧光，则对照成立，结果可以判定。7.3.3.2 判定标准被检组织的细胞浆中出现亮绿色荧光者，判为阳性，否则判为阴性。8 附录A(规范性附录)琼脂免症扩散试验用溶渡的配制A. 1 pH7.2 O. 01mol/L磷酸盐缓冲溶液CPBS)的配制磷酸氢二铀CNa2HP04 12H20) 磷酸二氢铀CNaH2P04)氯化铀CNaCD加蒸馆水至2.9 g 0.3 g 8.0 g 1000 mL 用氢氧化铀CNaOH)或盐酸CHCD调pH至7.2，灭菌或过滤。注:PBS一经
21、使用，于4C保存不超过3周。A.2 1%硫柳*溶渣的配制硫柳隶加蒸馆水至1. 0g 100 mL 溶解、过滤后，置100mL瓶中盖塞，4.C存放备用。GB/T 27527-2011 9 =oN|hNhNH白。国华人民共和国家标准禽脑脊髓炎诊断技术GB/T 27527-2011 中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平墨西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数19千字2012年1月第一版2012年1月第一次印刷导18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价书号:155066. 1-44038 GB/T 27527-2011 打印H期:2012年2月22H F002A
