1、ICS 11. 220 B 41 毒国中华人民ft -、和国国家标准GB/T 27535-20门猪流感HI抗体检测方法Detection method of hemagglutination inhibition antibody against swine influenza 2011-11-21发布2012-03-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准猪流感HI抗体检测方法GB/T 27535-2011 争6中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编
2、室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张0.5字数9千字2012年1月第一版2012年1月第一次印刷* 书号:155066 1-44052定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107目UJ:I 本标准按照GB/T1. 12009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标
3、准主要起草人:乔传玲、杨焕良、陈艳、辛晓光、陈化兰。GB/T 27535-2011 I 猪流感HI抗体检测方法1 范围本标准规定了猪流感病毒血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验的技术要求。本标准适用于猪流感血清HI抗体的检测。2 仪器水浴箱、4.C冰箱等。3 试验材料单道及多道微量移液器、吸头。4 试剂4.1 0.01 mol/L pH7. 2 PBS(参见附录A中A.口。4.2膜酶榕液(参见附录八中A.2)。4.3 0.01 mol/L KI04溶液(参见附录A中A.3)。4.4 J%丙三醇盐水(参见附录A中A.4)。4.5 阿氏CAlsevers)液(参见附录A中A.5)。4.6 0.5%鸡
4、红细胞悬液参见附录A中A.6)。4.7 HI试验抗原和阴、阳性血清(参见附录A中A.7)。5 血凝(HA)试验5. 1 用多道微量移液器在微量反应板的112孔均加入0.05mL PBS.换吸头。5.2 吸取0.05mL抗原，加入第1孔，反复抽打35次混匀。G/T 27535-2011 5.3 从第1孔吸取0.05mL抗原加入第2孔，海匀后吸取0.05mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换吸头。第12孔作为红细胞对照。5.4 每孔均加入0.05mL o. 5%(体积分数)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。5.5 轻轻混匀，室温(20.C25
5、.C)下静置20min后观察结果(如果环境温度太高，可置4.C环境下)。对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。5.6 结果判定:将反应板倾斜450，观察红细胞若没有呈泪滴状流淌，则判为HA阳性;完全血凝(不流淌)的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位(HAU)。6 血凝抑制(HI)试验6. 1 操作步骤6. 1. 1 血清样品的处理:待检血清样品需经膜酶-加热-高腆酸盐方法处理，以去除血清中非特异性GB/T 27535-2011 凝集抑制因子。其步骤为:先加0.15mL膜酶溶液于0.3mL血清中，在56.C水浴灭活30min后冷却至室温;:1100.9 mL高腆酸饵，混合，室温孵育15min;加0.
6、9mL丙三醇盐溶液，混合，室温孵育15min;加0.75 mL生理盐水并混合，置4.C保存备用。6. 1.2 根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4HAU的抗原。HA效价除以4即为含4HAU抗原的稀释倍数。例如，HA效价256，则4HAU抗原的稀释倍数应是64(256除以的。6. 1. 3 在微量反应极的211孔加入0.025mL PBS，第四孔加入0.05mL PBS. 6. 1. 4 吸取0.05mL血清(待检血清、阳性血清及阴性血清)加入第1孔内，从中吸取0.025mL于第2孔，充分混匀后吸0.025mL于第3孔，依次对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃去。6.1.5 11
7、1孔均加入含4HAU混匀的抗原0.025mL，第12孔作为红细胞对照。室温(20.C25 .C) 下静置10min30 min。6. 1. 6 每孔加入0.05mL O. 5%(体积分数)的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，室温(20.C 25 .C)下静置10min30 min(若环境温度太高，可置4.C条件下进行)，在红细胞对照孔呈钮扣状沉于孔底时即可判定结果。6.2 结果判定6.2. 1 检测结果成立的条件z己知阳性血清与相应抗原反应后出现预期的HI效价，阴性血清与抗原反应HI结果为阴性;反之试验重新进行。6.2.2 以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价。待检猪血清经过处理后
8、已作10倍稀释，如果血凝抑制有一个孔发生抑制，此时血清的效价即为1: 10，判为阳性。6.2.3 未经疫苗免疫的猪只经过14d后再次采样，测定，如果第二次的抗体高于第一次2个滴度，判为该猪处于感染期。7 注意事项7. 1 标准抗原稀释液浓度为4个HAU，并且在每次试验前进行标定。7.2 孵育时间要严格控制。红细胞对照完全沉淀时要迅速判读。在一些病毒株中可见红细胞从病毒中解脱，如果有这种情况的发生，要提前判定或置4.C下孵育。7.3 红细胞悬液始终符合标准。7.4 反应试剂要按规定保存和使用。为避免反复冻融和细菌污染，应以元菌操作将试剂分装成小包装。7.5 冻干的试剂应按照说明书中规定的体积重新
9、溶解并保存。2 A. 1 0.01 mol/L pH值7.2PS NaCl KCl NazHP04 KHzP04 灭菌双蒸水附录A(资料性附录)相关试剂的配制8 g 0.2 g 1. 42 g 0.27 g 800 mL G/T 27535-2011 NaOH或者HCl调pHC7.07.的，灭菌双蒸水加至1000 mL定容，121oC高压灭菌15min或过滤除菌。A.2 酶酶溶渍膜酶CP-250)200 mg 0.01 mol/L PBS 加至25mL 过滤除菌，分装保存于一200C或一70oC，每6个月重新配制膜酶。A. 3 O. 01 mol/L KI04溶班KI04 230 mg 0.0
10、1 mol/L PBS 加至100mL 过滤除菌，KI04溶液新鲜配制，在1周内使用。A.4 1%丙三醇盐水丙三醇0.01 mol/L PBS 过滤除菌。A.5 阿氏CAlsevers)灌葡萄糖拧棱酸铀拧朦酸氯化铀1 mL 99 mL 2.05 g 0.8 g 0.055 g 0.42 g 灭菌双蒸水至100mL NaOH或者HCl调pH6.1 121 oC高压灭菌15min , 2 oC8 oC保存备用。=ON|町的mhNH阁。GB/T 27535-2011 0.5%鸡红细胞悬波采集23只SPF公鸡或元禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用PBS液洗涤3次，以3000r/
11、min离心5min，洗涤后用PBS配成0.5%(体积分数)红细胞悬液，2oC8 oC 保存备用。A.6 HI试验抗原和阴、阳性血清抗原系用猪流感病毒接种SPF鸡胚，收获感染鸡胚液，用甲醒溶液灭活，经浓缩后，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成。用于HI试验，检测猪流感病毒的抗体。阳性血清系用猪流感病毒灭活疫苗免疫SPF鸡，采血、分离血清，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成;阴性血清系采集SPF鸡血，分离血清，冻干制成。用于猪流感病毒HI试验，分别作为阳性与阴性对照。使用冻干的抗原和血清时均按瓶签上规格标注的量，用灭菌生理盐水溶解。A.7 侵权必究9-AU n-4-O A性-nu-a斗nu-号一价书一定版权专有GB/T 27535-2011 打印H期:2012年2月22H F002A
