1、ICS 11. 220 B 50 道B中华人民圭t./、不日国国家标准G/T 27623. 1-20门渔用抗菌药物药效试验技术规范第1部分:常量肉汤稀释法药物敏感性试验Pharmacodynamic test technical specification for aquacuIture antimicrobial agent-Part 1 : Antibiotics susceptibility test of macro-broth dilution method 2011-12-30发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-04-01实施发布目U
2、=i GB/T 27623(渔用抗菌药物药效试验技术规范分为两个部分z第1部分z常量肉汤稀释法药物敏感性试验;第2部分:人工感染防治试验。本部分为GB/T27623的第1部分。本部分按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本部分起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所。本部分主要起草人:刘琪、李健、王群、戴芳链。GB/T 27623.1-2011 I 1 范围渔用抗菌药物药效试验技术规范第1部分:常量肉汤稀释法药物敏感性试验GB/T 27623.1-2011 GB/T 27623的本部分规定了
3、渔用抗菌药物的常量肉汤稀释法药物敏感性试验所需的试剂和材料、仪器设备、操作步骤和质量控制。本部分适用于渔用抗菌药物的常量肉汤稀释法药物敏感性试验。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法中华人民共和国兽药典(2010年版)中华人民共和国农业部公告第1521号3 试剂和材料3. 1 化学试剂除非另有说明，本部分使用确认为分析纯的化学试剂。3.2 实验用水除非另有说明，应符合GB/T6682中三级水的规格。3.3 Mu
4、eller-Hinton琼脂(M-H琼脂)培养基按产品说明用干粉培养基制备平板，其中用于弧菌试验的M-H琼脂培养基中需添加1.5%的氯化铀。3. 4 Mueller-Hinton肉汤(M-H肉汤)培养基按产品说明用干粉培养基制备M-H肉汤，其中用于弧菌试验的M-H肉汤培养基需添加氯化铀至终浓度为1.5%。每一批M-H肉汤培养基的pH值在室温下应为7.27. 4，应含有20mg/L 25 mg/L Ca2+和10mg/L12. 5 mg/L Mg2+。如果采用原子吸收光谱法等方法测得培养基CaZ+和MgZ+含量不够时，应向培养基中添加适量元菌的CaZ+和MgZ+溶液(续离子和钙离子溶液的制备方法
5、见附录A);添加了CaZ+和Mg2+的M-H肉汤培养基不可再次高压灭菌。3.5 0.85%无菌生理盐水称取8.50g(精确到0.01g)分析纯氯化铀，加入1L蒸饵水溶解后121C 15 min高压灭菌。G/T 27623.1-20门3.6 实验菌株3.6.1 实验菌株应选用来自国家级微生物菌种保藏中心的标准致病菌株或具有资质的菌种保藏机构提供的分类地位明确的致病菌株，也可以使用临床分离的致病菌株，使用临床分离的致病菌株时应至少鉴定至属。其中质控菌株为荧光假单胞菌(AS1.180)和副溶血弧菌(AS1.1614) ，质控菌株应来自国家级微生物菌种保藏中心或具有资质的菌种保藏机构。3.6.2 日常
6、使用的质控菌株荧光假单胞菌应在M-H琼脂上，副榕血弧菌应在添加1.5%氯化铀的M-H琼脂上于4c 8 oC的冷藏箱中保存;质控菌株的使用代次为3代14代;质控菌株应至少一个月更换一次，由冻干或超低温冷冻保存菌种移种或购买新菌种。3. 7 质控药物z盐酸土霉素，含量95%以上，应符合中华人民共和国兽药典(2010年版)要求。4 仪器设备4. 1 恒温箱:可满足28oC :l: 1 C。4.2 移液器z量程40L200L、100Ll000L、1000L5000L。4.3 元菌操作台z可满足元菌要求的洁净工作台、生物安全柜或无菌室等。4.4 分析天平t精确至1mgo 5 操作步骤5. 1 抗菌药物母
7、液的制备5. 1. 1 抗菌药物母液的浓度抗菌药物母液的浓度应至少为最高测试浓度的10倍，但对于某些溶解性低的抗菌药物可以制备较低浓度的母液。5. 1. 2 溶剂和稀释液用于制备抗菌药物母液的溶剂和稀释液见附录B。除蒸馆水可高压灭菌外，其余应采用O.22m 微孔滤膜过滤除菌。5.1.3 母液的制备称取不低于0.10g抗菌药物，精确到1mg;在元菌条件下使用5.1.2中溶剂和稀释液配制抗菌药物母液。5.2 抗菌药物药液浓度的建立抗菌药物药液的浓度按倍比稀释来建立，试验要在元菌条件下于适宜的玻璃试管中进行。试验中取10支试管排成一列，在第1管中加入适量的渔用抗菌药物母液和M-H肉汤(总体积以2mL
8、10mL为宜)，使其浓度为试验的最高浓度。第210管均加入第1管总体积二分之一的M-H肉汤。第1管混匀后取二分之一的量加入第2管中，混匀后从第2管中取二分之一的量加入第3管中，依次类推到第8管，混匀后第8管吸取二分之一的量弃掉，第9，10管不加药物，第9管作为细菌生长情况对照，第10管作为元菌控制对照。n u GB/T 27623.1-2011 5.3 菌液接种5.3. 1 起始培养菌落接种的菌落由新鲜的M-H琼脂培养基平板划线待测菌的单菌落来制备，孵育温度为28oC，除非是缓慢生长菌株，否则平板培养时间不应超过24h。5.3.2 接种菌渡的制备接种菌液通过在0.85%元菌生理盐水中，乳化至少
9、3个起始培养单菌落来制备。用0.85%元菌生理盐水校正菌液浓度与O.5麦氏单位标准比浊管相同(标准比浊管见附录。，即菌液浓度为1X10日CFU/mL2X108 CFU/mL。然后用M-H肉汤稀释至所需浓度。5.3.3 菌液接种菌液接种后的最终浓度约为5X 105 CFU/mL。一旦接种菌液在M-H肉汤中被稀释，则15min 内，接种菌液应加入每个试管中，但作为元菌控制的试管除外。5.4 孵育接种菌液后应尽快放人280C恒温箱中孵育，标准孵育时间为24h，但对缓慢生长菌株(如爱德华氏菌)孵育时间为48h。5.5 读取试验结果抗菌药物敏感性试验结果用最小抑菌浓度(minimuminhibitory
10、 concentration, MIC)表示，即肉眼观察试管中细菌生长完全被抑制时的最小抗菌药物浓度记录为MIC;同时测定质控药物对质控菌株的MICo6 质量控制6. 1 最小抑菌浓度(MIC)的控制限值根据实验菌株的特性，选用荧光假单胞菌(AS1.180)或副溶血弧菌(AS1.1614)为质控菌株，使用盐酸土霉素为质控药物。盐酸土霉素对荧光假单胞菌的MIC质控范围均为2.0 mg/L 8. 0 mg/L;对副溶血弧菌的MIC质控范围均为1.0 mg/L4. 0 mg/L;当质控药物对质控菌株的MIC超出质控范围时，MIC结果需舍弃重做。6.2 污染和细菌生长控制元菌控制的培养基试管出现污染或
11、不含抗菌药物的试管细菌未见明显生长时需舍弃全部MIC结果;任何一列(排)出现跳管现象时，该列(排)MIC结果应舍弃。7 结果报告试验结果的报告包括受试药物对实验菌株的MIC、质控药物对质控菌株的MIC和实验菌株的名称、来源、孵育时间。3 GB/T 27623.1-20门附录A(规范性附录)镜离子和钙离子溶液的制备将8.36g的MgCb.6H20溶解于100mL蒸馆水中CMg2+浓度为10mg/mL)制成镜离子溶液;将3.68g的CaCb 2H20溶解于100mL蒸馆水中CCa2+浓度为10mg/mL)制成钙离子溶液，0.22m微孔滤膜过滤除菌后于40C保存。4 GB/T 27623.1-20门
12、附录B(规范性附录)制备抗菌药物母渣的溶剂和稀释液表B.1制备抗菌药物母液的溶剂和稀释液抗菌药物溶剂稀释液阿莫西林、克拉维酸和替卡西林磷酸盐缓冲液，pH6.0 , 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液，pH6.0 , O. 1 mol/L 氨带西林磷酸盐缓冲液，pH8.0 , O. 1 mol/L 磷酸盐缓冲液，pH8.0 , O. 1 mol/L 阿奇霉素95%乙酶蒸馆水氨曲南饱和碳酸氢销溶液蒸饱水头抱替坦二甲亚枫蒸馆水头抱毗后磷酸盐缓冲液，pH6.0 , O. 1 mol/L 磷酸盐缓冲液，pH6.0 , O. 1 mol/L 头抱泊后碳酸氢纳溶液，0.10%，11.9mmol/L 蒸饱水头抱
13、他脆碳酸销溶液，10.0%蒸馆水头抱喔吩磷酸盐缓冲液，pH6.0 , 0.1 mol/L 蒸馆水甲枫霉素、氟苯尼考和红每素95%乙醇蒸馆水土霉素0.05 mol/L盐酸蒸馆水克拉霉素甲醇磷酸盐缓冲液，pH6.0 , 0.1 mol/L 西诺沙星、奈院酸、依诺沙星、氟二分之一体积水，逐滴加入1mol/L 蒸馆水罗沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星氢氧化销至溶解亚胶培南磷酸盐缓冲液，pH7.2 , 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液，pH7.2 , 0. 1 mol/L 拉氧头子包(双镀盐)0.04 mol/L盐酸(放置1.5h2h)磷酸盐缓冲液，pH6.0 , O. 1 mol/L 利福平甲自享蒸馆水(搅
14、拌)磺胶类二分之一体积热水和最少量的蒸馆水2.5 mol/L氢氧化纳至溶解甲氧节度10%终体积的0.05mol/L盐酸或蒸馆水(必要时加热乳酸注2可用蒸饱水作溶剂和稀释剂的药物有阿米卡星、阿洛西林、竣苇西林、头抱克洛、头子包蒙多、头子包美瞠、头抱尼西、头抱唾厉、头抱嚓皖、头抱瑾吠、头抱q原因、头抱西丁、头抱瞠厉、头子包曲松、环丙沙星、恩、诺沙星、盐酸沙拉沙星、吠哺西林、克林霉素、庆大霉素、卡那霉素、加替沙星、甲氧西林、美洛西林、奈夫西林、奈替米星、苯瞠西林、青霉素、吸拉西林、四环索、妥布霉素、甲氧书呢(盐酸盐)、大观霉素、万古霉素、盐酸土豆革素。5 GB/T 27623. 1-2011 附录C
15、(规范性附录)标准比浊管C.1 用硫酸顿比浊管(0.5麦氏单位标准比浊管)，标定接种菌液浓度。C.2 比浊管制备方法:取0.048mol/L氧化顿(BaC12)(质量体积分数为1.175%的BaCb 2H20) 0.5 mL，加到99.5mL的0.18mol/L硫酸(体积分数为1%)溶液中，制成标准比浊管。用光径为1cm的分光光度计测定吸光度来标定比浊管。O.5麦氏单位标准比浊管在625nm波长的吸光度应为O. 080. 100选管径与制备菌液试管相同的螺口试管，每管分装4mL6 mL。将试管帽拧紧，放室温暗处保存。比浊管用前在旋转振荡器上混匀。如出现较大颗粒，应更换比浊管。每个月更换比浊管或
16、复验比浊管的浊度。6 FFON-dNhNH阁。华人民共和国家标准渔用抗菌药物药效试验技术规范第1部分:常量肉汤稀释法药物敏感性试验GB/T 27623.1-2011 国由t祷中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张0.75字数13千字2012年3月第一次印刷开本880X12301/16 2012年3月第一版* 书号:155066. 1-44359 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 27623.1-2011 打印H期:2012年4月1H F002A
