1、ICS 11.220 B 41 道昌和国国家标准11: ./、中华人民GB/T 27635-20门斑点叉尾锢嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法Protocol of identification of Stenotrophomonas maltophilia from Ictalurus punctatus Rafinsque 2011-12-30发布数码防伪/中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局中国国家标准化管理委员会2012-04-01实施发布目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SACjTC181)归口。
2、GB/T 27635-2011 本标准起草单位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人z薛峰、蒋原、袁芳、王云飞、张睿、易海华、徐帮兴、邵卫星、马卉、来军、陈国强、乔华林、谢怀根。I 1 范围斑点叉尾细嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法本标准规定了斑点叉尾倒嗜麦芽寡养单胞菌的分离与鉴定方法。本标准适用于对斑点叉尾倒的嗜麦芽寡养单胞菌的分离、鉴定。2 规范性引用文件GB/T 27635-2011 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T
3、4789. 28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法3 缩略语下列缩略语适用于本文件。NA: nutrient agar，普通营养琼脂。TSA : tryptose soya agar，大豆膜蛋白陈琼脂。VIA: amphotericin B; imipenem; vancomycin hydrochloride，含有万古霉素、亚胶培南、两性霉素B的选择性平板。4 设备和材料4. 1 冰箱:OoC40C。4.2 恒温培养箱:28 oC:!: 1 oC。4.3 铀/银接种环或玻璃棒。4.4 滤纸。4.5 发酵管。4.6 天
4、平:0g100 g，精确至O.5 g。4. 7 均质器或灭菌乳钵。4. 8 灭菌广口瓶:500mL。4.9 灭菌三角烧瓶:500mL, 250 mL。4. 10 灭菌培养皿:直径90cm o 4. 11 显微镜:10X100X。5 试剂和培养基5. 1 试剂级别:除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682-2008规定的二级水，所用化学试剂G/T 27635-2011 均为分析纯。5.2 普通营养肉汤、大豆膜蛋白陈琼脂(TSA)、普通营养琼脂(NA)、普通羊血营养琼脂和VIA的配制见附录A(也可按GB/T4789.28一2003中4.7规定。5.3 革兰氏染色液:按GB/T4789.28
5、-2003中2.2规定。5.4 氧化酶试剂z按GB/T4789. 28-2003中3.18规定。5.5 糖发酵管z麦芽糖按GB/T4789.28-2003中3.2规定。5.6 DNA酶甲基绿琼脂z按GB/T4789. 28-2003中4.51规定。5. 7 微量生化反应管:乳糖、水杨昔、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丙二酸盐、玻甜酸盐、延胡索酸盐、L-苹果酸盐、乳酸盐、拧攘酸盐、2-酣戊二酸盐、丙嗣酸盐生化反应，L-丙氨酸、D丙氨酸、L-谷氨酸盐、L-组氨酸和L-脯氨酸，按照GB/T4789.28一2003中规定。5.8 API20E生化鉴定试剂盒。6 检验程序斑点叉尾倒嗜麦芽寡养单胞菌检验程序见图
6、102 于225mL普通营养肉汤中增菌，28C士1c , 需氧培养24h VIA琼脂上划线，28c士1c 需氧培养24h 挑取平板背景未变黄色的可疑菌落接种大豆族蛋白陈琼脂或普通营养琼脂，或者普通羊血琼脂，28C 麦芽糖氧化实验、DNA酶反应实验图1斑点叉尾锢嗜麦芽喜养单胞菌检验程序G/T 27635-2011 7 操作步骤7. 1 样晶处理霞的制备以元菌操作取出有病症鱼体，直接从鱼体肝、肾等组织中采祥。如果是体长小于4cm的幼鱼取整条鱼，如果是体长4cm6 cm的鱼取内脏。将鱼体或内脏25g均质于225mL营养肉汤中，28.C土1.C , 需氧培养24h，无菌取培养液作为样品处理液。7.2
7、细菌的分离将24h普通营养肉汤增菌液划线接种于VIA，置于28.C需氧培养24h，显微镜观察，背景未变化的单个优势菌落为可疑菌落。7.3 可疑菌落筛选挑取背景未变化的单个优势可疑菌落于大豆膜蛋白陈琼脂或普通营养琼脂或者普通羊血平板，置于28.C需氧培养24h.观察菌落的大小、形态，在普通营养琼脂上菌落呈灰白色，圆形，表面光滑，边沿整齐的半透明菌落;在大豆膜蛋白陈琼脂(TSA)平板上形成圆形，表面光滑，边缘整齐，直径。.18 mm1. 12 mm的透明的无色菌落;在普通羊血琼脂平板上出现明显的R溶血环，且溶血环呈草绿色，有强割的氨味。符合以上菌落特征的为可疑菌株。7.4 晴麦芽寡养单胞菌的鉴定7
8、.4. 1 革兰氏接色对可疑菌落进行革兰氏染色，嗜麦芽寡养单胞菌为G-杆菌，无英膜，无芽抱，极生端鞭毛，鞭毛数不小于2。7.4.2 氧化酶实验使用铅/钝接种环或玻璃棒，挑取单个可疑菌落，然后接种到用氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在10 s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性，不变色为阴性，嗜麦芽寡养单胞菌为阴性。7.4.3 麦芽糖氧化实验将可疑菌落无菌挑取到麦芽糖发酵管，28c士1C培养2h3 h，观察结果。嗜麦芽寡养单胞菌为氧化麦芽糖强阳性。7.4.4 DNA酶反应实验在以甲基绿为指示剂的DNA酶培养基的试管或平皿上检测DNA酶活性，在该培养基上，围绕DNA酶阳性的细菌菌落的周围有一个清亮的环。
9、将可疑菌落接种到上述DNA酶反应培养基中，28.C需氧条件下培养72h，观察结果。嗜麦芽寡养单胞菌为DNA酶反应阳性。7.4.5 其他生化反应7.4.5. 1 API20E鉴定对上述均符合的可疑菌株用API20E生化鉴定试剂条鉴定，具体操作按照产品说明书进行。3 GB/T 27635-2011 7.4.5.2 微量反应生化管实验除API20E鉴定方法外，也可以利用微量反应生化管，做乳糖、水杨昔、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丙二酸盐、玻王自酸盐、延胡索酸盐、L-苹果酸盐、乳酸盐、拧攘酸盐、2-酣戊二酸盐、丙酣酸盐、L-丙氨酸、D丙氨酸、L-谷氨酸盐、L-组氨酸和L-脯氨酸生化实验。嗜麦芽寡养单胞菌均
10、可以利用上述有机物，反应均为阳性。8 结果报告可疑菌落全部符合7.4中的报告阳性结果检出嗜麦芽寡养单胞菌，否则报告阴性结果未检出嗜麦芽寡养单胞菌。4 A.1 普通营养肉汤A. 1. 1 基础培养基成分蛋白陈牛肉膏氯化铀蒸懦水A. 1.2 制备附录A(规范性附录)培养基与试剂10 g 3 g 5 g G/T 27635-2011 1 000 mL 用蒸馆水溶解培养基基础成分，调节pH7.4，选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，121oC 15 min高压灭菌。A.2 大豆膜蛋白陈琼脂(TSA)A. 2.1 基础培养基成分膜陈植物蛋白陈氯化铀琼脂蒸馆水A.2.2 配制15.0 g 5.0 g 3
11、0.0 g 15.0 g 1 000 mL 用蒸馆水溶解培养基基础成分，调节pH，以确保灭菌后pH为7.2士0.2(25OC)，选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，121oC 15 min高压灭菌。A.2.3 制备当基础培养基的温度降至47.C 50 .C时，混匀。倾注15mL基础培养基于灭菌平皿中，静置使凝固。A.3 普通营养琼脂培养基(NA)A. 3.1 基础培养基成分蛋白陈氯化铀牛肉膏粉酵母膏粉12 g 5 g 3 g 3 g 5 GB/T 27635-2011 琼脂蒸馆水A.3.2 配制3 g 1000 mL 用蒸锢水溶解培养基基础成分，调节pH，以确保灭菌后pH为7.2土0.2(2
12、5C)，选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，121oC 15 min高压灭菌。A.3.3 制备当基础培养基的温度降至47oC 50 oC时，混匀。倾注15mL基础培养基于灭菌平皿中，静置使凝固。A.4 普通羊血琼脂A. 4.1 基础培养基A. 4. 1. 1 成分动物组织酶解物淀粉氧化铀琼脂水A.4. 1. 2 配制23.0 g 1. 0g 4.0 g 8. 0 g18. 0 g 1 000 mL 将基础组分溶于水，加热以促进溶解。调节pH，使培养基在高压灭菌后，在24.C时的pH为7.3土0.2，选取适当三角瓶进行分装。121.C 15 min高压灭菌。A.4.2 合成培养基A. 4. 2
13、.1 组分basic medium(基础培养基，见A.4.1)sterile defibrinated horse/ sheep blood(元菌脱纤维马/羊血)A. 4. 2. 2 制备1 000 mL 50 mL 当基础培养基的温度降至47.C 50 .C时，加入无菌脱纤维马/羊血5mL/100 mL，混匀。倾注15 mL合成培养基于灭菌平皿中，静置使凝固。A.5 VIA A. 5.1 基础培养基A.5. 1. 1 成分6 蛋白陈牛肉浸音D-甘露醇10.0 g 1. 0g 10.0 g 氯化铀琼脂澳百里酣蓝A. 5.1.2 配制5.0 g 15.0 g 0.06 g GB/T 27635-
14、2011 将基础培养基组分溶于水，加热以促进溶解。调节pH，使培养基在高压灭菌后，在25oc时的pH为7.3:1:0.2，选取适当三角瓶进行分装。121oC 15 min高压灭菌。A.5.2 抗生素溶液A. 5. 2.1 成分vancomycin hydrochloride(万古霉素)imipenem(亚服培南)amphotericin B(两性霉素B)A.5.2.2 制备用水溶解上述成分并且过滤除菌。A.5.3 合成培养基A. 5. 3.1 成分基础培养基(见A.5. 1)，抗生素溶液(见A.5. 2)。A.5.3.2 制备5 mg/L 32 mg/L 2.5 mg/L 当基础培养基的温度降
15、至47oC50 oC时，加入抗生素溶液，混匀，形成合成培养基。倾注15mL 此合成培养基于灭菌平皿中，静置使凝固。-FON|町的hNH阁。华人民共和国家标准斑点叉尾翻晴麦芽寡养单胞菌检测操作方法GB/T 27635-2011 国申a 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销当&印张0.75字数15千字2012年3月第一次印刷开本880X12301/16 2012年3月第一版* 书号:155066. 1-44347 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价G8/T 27635-2011 打印H期:2012年3月21H F002A
