1、道BICS 11. 220 B 41 共和国国家标准中华人民GB/T 27640-20门断技术撞诊马Diagnostic techniques for horsepox disease 2012-04-01实施2011-12-30发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会数码防伪中华人民共和国国家标准马擅诊断技术GB/T 27640 2011 * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946
2、中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张0.75字数17千字2012年3月第一版2012年3月第一次印刷每H号:155066. 1-44372定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 27640-2011 目lJ=i 本标准按照GB/T1. 1-2009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人:梁成珠、朱来华、肖西志、
3、郑小龙、邓明俊、岳志芹、毕道荣、梁君妮、徐彪。I 马症诊断技术1 范围本标准规定了马症临床诊断、病毒分离与鉴定等诊断技术要求。本标准适用于马症的诊断。2 临床检查2. 1 临床特征GB/T 27640-2011 病马于系部和球节处的皮肤上出现丘磨，随后变为水痕，最后为腺癌，并干酒而结册。由于局部疼痛，可引起眼行，病马一般不显全身症状;有的病马于唇内侧、齿踉、舌、舌系带、颊部等粘膜上发生症彦，也是先发丘彦，继而水痕和服瘤，腺癌破裂形成浅的溃癌z母畜外生殖器水肿，并在皮肤和粘膜上形成水痛、服殖和溃扇，公畜的病变表现为阴茎、包皮和龟头上的症彦样病变。2.2 初步判定2.2. 1 根据临床特征可作出病
4、马感染马症的初步判定。2.2.2 最终判定应进行病毒分离鉴定。3 病毒分离3. 1 样品采集和运送要求采取病变部位的渗出液、水殖液和溃痛部位组织作为采集对象，尽量元菌采集，采集后低温送实验室进行病毒分离。3.2 病毒分离试验3.2.1 所需仪器、设备3.2.1.1 C:()2培养箱。3. 2. 1. 2 II级生物安全柜。3.2.1.3 倒置显微镜。3.2. 1. 4 带冷冻功能的离心机。3.2.2 材料准备3.2.2.1 细胞培养基DMEMo3. 2. 2. 2 Hela细胞。3. 2. 2. 3 Hanks液(Hanks液，见A.1;含抗生素，见A.的。3.2.2.4 小牛血清。3.2.2
5、.5 待检马组织:采取病变部渗出液、水痕液或丘磨和溃荡部组织作为标本，用Hanks液配制成1 : 10悬液，以1500 r/min离心10min，取上清备用。1 GB/T 27640-20门3.2.2.6 接种方法:用含10%小牛血清的DMEM培养液培养Hela细胞，待细胞长成单层后弃去培养液。将3.2.2.5中的待检组织接种Hela细胞，然后加入含5%小牛血清的DMEM培养液。CO2培养箱内37.C ,48 h后观察细胞病变。3.3 判定如果48h后出现明显的细胞病变，如细胞圆缩、聚集，可进一步做病毒鉴定。正常的Hela细胞为多角形，贴壁生长。4 电子显微镜检查4. 1 材料准备4. 1.
6、1 戊二醒，碳网膜，三起甲基氨基甲烧-乙二胶四乙酸(Tris-EDTA) ，磷鸽酸(pH7.2)，滤纸，载玻片。4. 1.2 病毒液或待检病料，如病变部位的渗出被或水癌液。4.2 负染操作方法4.2.1 用戊二醒固定待检病料。4.2.2 负染方法为z取一滴待检病料于载玻片上，将碳网膜漂浮于液滴上1min，再置于一滴三是甲基氨基甲烧-乙二股四乙酸(Tris-EDTA)缓冲液中浸泡20s，然后用一滴1%的磷鸽酸(pH7.2)染色10s. 取出碳网膜，用滤纸吸干膜上液体，待自然干燥后镜检。4.3 判定电镜下见到砖形或大卵圆形，有一个双凹面的核心体，同时具有包膜。观察到上述结果，可判定为马症感染。5
7、分子生物学检测5. 1 材料准备5. 1. 1 待检样晶材料分离的病毒、病毒感染的细胞或所采集的病料，如病变部位的渗出液或水癌液。5. 1. 2 仪器设备PCR仪，恒温水浴锅，电泳仪，冷冻离心机，凝胶成像系统或其他类似设备(观察电泳结果)，微波炉或相关仪器(琼脂糖凝肢的制备)，超声波破碎仪，一20.C冰箱。5.1.3 试剂0.25%膜蛋白酶溶液(见A.2)，RNase，70%乙晖，TaqDNA聚合酶，PBS缓冲液，酣三氯甲:皖，引物，dNTPs，去离子水，加样缓冲液，电泳缓冲液，漠化乙键溶液(见B.3)或相关染料(现在已经有澳化乙链的替代产品，而且元致癌性，如GelRed)。缓冲液的配方见附录
8、B。5.2 病毒基因组DNA的制备用0.25%的膜酶消化感染病毒的Hela细胞，3000r/min离心5min，收集的细胞沉淀用PBS缓冲2 GB/T 27640-2011 液重悬，于950C水浴灭活30rnin。重复离心，收集沉淀。再用2rnL PBS缓冲液重悬细胞。将细胞至于冰浴，超声波粉碎，输出功率为40W，时间3rnin，每5s暂停5s。细胞经破碎后加入10LRNase, 370C反应30rnino待溶液温度降至室温后，加入400L酣三氯甲烧，混匀后于冰浴中放置5rnin，然后13000 r/rnin离心5rnin，收集DNA沉淀。用70%乙障洗沉淀一次。空气干燥沉淀，加入100L去离
9、子水溶解DNA，分装保存于200C冰箱中备用。本步骤也可采取相关商品化的病毒DNA提取试剂盒。采集的病料可采取同样的方法或用商品化试剂盒进行病毒DNA的提取。5.3 噩苗病毒血细胞凝集素HACHemagglutinin，HA)基国的PCR扩增5.3. 1 引物序列上游引物:5-ATGACA CGA TTG CCA ATA C-3; 下游引物:5 -CT A GAC TTT GTT TTC TG-3。5.3.2 各反应物浓度引物25prnol/fLL ,dNTPs 2.5 rnrnol/fLL，TaqDNA聚合酶5U/ fLL，反应体系为25L。5.3.3 扩增条件930C ,5rnin, 92
10、0C ,30s;550C ,30s ;72 oC，lrni凡共35个循环。预扩增片段大小为940bpo 5.3.4 电泳制备1%琼脂糖凝胶板，加样6L8L，电压80V100 V，电流40rnA50 mA，电泳30rnin 40 rnino 5.4 马症病毒的PCR检测5.4. 1 引物序列上游引物:5人GAAAATCCAGATACAGCCACC-3勺下游引物:5-ACGCTGAAACGGAACCTGTAT-3。5.4.2 各反应物浓度引物25prnol/ fLL , dNTPs 2. 5 rnmol/L，TaqDNA聚合酶5U/ fLL，反应体系为25L。5.4.3 扩增条件930C ,5 r
11、nin , 93 oC , 30s, 530C，30s，720C，30s，35个循环。预片段大小为637忡。5.4.4 电泳制备1%琼脂糖凝胶板，加样6L8L，电压80V100 V，电流40rnA50 rnA，电泳30rnin 40 rnino 5.4.5 结果判定如果不出现940bp和637bp大小的片段，判定为阴性;如果出现940bp和637bp中的任何一个片段则判定为阳性，并对PCR产物进行测序，与参考毒株进行序列比对。9 u GB/T 27640-2011 6 结果的综合判定根据2.2，可作出初步判定。确诊需要根据4.3、5.4.5进行最终判定，如果电子显微镜检查发现特征性病毒粒子可判
12、为马症阳性，否则为阴性;如果PCR检测结果为阳性，可判为马症阳性，否则为马症阴性。当4.3和5.4.5结果不一致时，以5.4.5结果为准。4 A.1 汉克液(Hanks)(10倍浓缩液)A. 1. 1 成分A. 1. 1. 1 成分甲氧化铀氧化饵氧化钙硫酸镜(MgS04 7H20) A. 1. 1. 2 成分Z附录A(规范性附录)细胞培养用试剂的配制80.0 g 4.0 g 1. 4g 2.0 g 磷酸氢二铀(Na2HP04 12H20) 1. 52 g 磷酸二氢饵0.6 g 葡萄糖10.0 g 1%酣红16 mL A. 1.2 配制方法GB/T 27640-2011 按顺序将上述成分分别溶于
13、双蒸水450mL中，即配成甲液和乙液，然后将乙液缓缓加入甲液，边加边搅拌。补足双蒸水至1000mL。用滤纸过滤后，加入三氯甲皖2mL，置2.C8 .C保存。A. 1.3 使用方法使用时，用双蒸水稀释10倍，107.6kPa灭菌15min，置4.C保存备用。用前以7.5%碳酸氢铀溶液调pH为7.27.4oA.2 0.25%膜蛋白酶溶液A. 2.1 成分氧化铀氯化饵拧棱酸铀(Na3CsHs07.5H20) 磷酸二氢铀(NaH2P04.2H20) 碳酸氢铀膜蛋白酶(1: 250) 双蒸水A.2.2 配制方法8.0 g 0.2 g 1. 12 g 0.056 g 1. 0g 2.5 g 加至1000m
14、L 放2.C8.C冰箱过夜，待膜酶充分溶解后，用碳酸氢铀溶液调pH为7.47. 6.用o.2m的微5 G/T 27640一-2011孔膜或G6型玻璃滤器滤过除菌。分装于小瓶中，一20.C保存。A.3 EDTA-膜蛋白酶分散液(10倍浓缩渡)A. 3.1 成分氧化铀氯化饵葡萄糖碳酸氢铀80.0 g 4.0 g 10.0 g 5.8 g 膜蛋白酶(1: 250) 5.0 g 乙二胶四乙酸二铀(EDTA-2Na) 2.0 g 按顺序溶于双蒸水900mL中，然后加入下列各液21%酣红溶液2.0 mL 青霉素(10万IU/mL)链霉素(10万g/mL)补足双蒸水至10.0 mL 10.0 mL 1000
15、 mL A.3.2 过滤除菌用0.2m的微孔膜或G6型玻璃滤器滤过除菌。分装小瓶，一20.C保存。A. 3. 3 分装临用前，用双蒸水稀释10倍，适量分装于试管中，-20.C冻存备用。A.3.4 使用方法分散细胞时，将细胞分散液取出融化后，再置35.C 37 .C热水中预热，并用7.5%碳酸氢铀调pH为7.68. O. A.4 抗生素溶液(1万IU/mL)A. 4. 1 10倍浓缩液青霉素链霉素双蒸水400万IU(80万单位/瓶X5瓶)400万四(100万单位/瓶X4瓶)40 mL 溶液充分混合后，分装小瓶，放-20.C保存。A.4.2 工作溶遭取上述浓缩液适量，用双蒸水稀释10倍，分装后放于
16、一20.C保存备用。A. 5 Tris-EDT A缓冲液6 10 mmol/L Tris Cl , pH7. 5 1 mmol/L EDT A , pH8.。GB/T 27640-2011 A.6 5%乳汉液水解乳蛋白5g 汉克氏液1000 mL 完全溶解后适量分装，经107.6kPa灭菌15min，放2.C8.C保存备用，用时以7.5%碳酸氢铀溶液调pH到7.27. 40 FFON|O叮hNH阁。GB/T 27640-2011 附录(规范性附录电泳用试剂的配制B 10 x加样缓冲液20%(质量浓度)Ficoll 400 0.1 mol/L Na2EDTA, pH8.0 1.0%(质量浓度)S
17、DS 0.25% (质量浓度)澳酣蓝0.25% (质量浓度)二甲苯青B.1 242 g 57.1 mL 37.2 g 50XTAE电泳缓冲液Tris碱冰乙酸Na2EDTA.2H20 加H20至1L。B.2 1000 x滇化Z链溶液澳化乙链H20 按1: 1000稀释配制凝胶和染色液，榕液应避光。小心:澳化乙键是一种诱变剂，必须小心操作。50 mg 100 mL B.3 8 g 0.2 g 1. 42 g PBS缓冲液NaCl B.4 KCl Na2HP04 KH2P04 0.27 g 溶于1L去离子水中，调节pH至7.4。高温高压灭菌，室温保存。侵权必究书号:155066 1-44372 定价:陪版权专有16.00 j乙GB/T 27640-2011 打印H期:2012年4月12H F002A
