1、ICS 65.020.01 B 16 GB 和国国家标准11: /、中华人民GB/T 28062-20门柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法Detection of Candidatus Liberibacter asiaticus using the real-time fluorescent PCR 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪 中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会发布GBjT 28062-2011 目U吕本标准按照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SACjTC271)提出并归口。本标准起草单
2、位:重庆大学、农业部农业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人:殷幼平、王中康、王玉奎、高文娜、夏玉先、曹月青、彭国雄、李正国。I GB/T 28062-2011 柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法1 范围本标准规定了柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibacter asiaticus)实时荧光PCR检测的样品制备、检测操作方法及结果判定标准。本标准适用于对芸香科和非芸香科植物罹病植株和传播媒介柑桔木虱中黄龙病亚洲韧皮杆菌的检测和病害鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件
3、。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 5040 柑桔苗木产地检疫规程GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 柑桔黄龙病Citrus Huanglongbing 一种由韧皮杆菌引起的植物检疫性病害。主要侵染柑桔属、金柑属和积属等柑桔类植株重。由带菌种苗远距离传播，田间主要由柑桔木虱取食传播。典型受害植株叶片斑驳不均匀黄化，枝梢黄化，果实畸形，种子败育，严重时可引起植株死亡。3.2 实时荧光PCRreal-time fluorescent PCR 实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊D
4、NA片段的方法，在扩增过程中由于荧光物质的释放或荧光物质与扩增产物结合并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。3.3 扩增引物primer 人工合成的寡核昔酸序列，其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增。3.4 扩增模板templet DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。3.5 Ct值cyclethreshold value 实时荧光PCR反应中每个反应管内荧光信号达到设定阔值时所经历的循环数。3.6 亚洲韧皮杆菌重组质粒DNArecombinant plasmid DNA 利用特异性引物扩增柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌基因组模板，获得的亚洲韧皮杆菌特异性
5、DNA扩GB/T 28062-2011 增序列，经构建重组质粒、转入大肠杆菌M109菌株中繁殖培养后，重新提取获得的质粒DNA。用于作为柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌实时荧光PCR检测的阳性对照。4 柑桔黄龙病菌基本信息学名:亚洲韧皮杆菌Candidatus Liberibacter asiaticus 0 病害名称:柑桔黄龙病，常用英文名:CitrusHuanglongbing o 分类地位:-阮细菌亚纲、根瘤细菌目(Rhizo biales) ，根瘤细菌科(Rhizo biaceae) ，韧皮杆菌属Liberibacter的G一细菌。是一种难培养细菌。引起柑桔黄龙病的韧皮杆菌根据其核糖体基因序列的
6、差异可以分为3种，即分布于非洲的柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌CandidatusLiberibacter african山，分布于南美洲的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌Candidatus Liberibacter americanus和分布于亚洲及北美的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌CandidatusLiberi bacter asiaticus J agoueix et aL 柑桔黄龙病菌其他信息参见附录A。本标准规定了对亚洲韧皮杆菌的检疫鉴定方法。对来自于非洲的柑桔材料的检疫检验，可参见附录B检测柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌;对来自美洲的柑桔材料，除利用本标准检测柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌外，可参见附录C检测柑桔黄龙
7、病美洲韧皮杆菌。5 方法原理本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是，利用病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法)，或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针，探针5端和3端分别标记荧光素报告基团和捍灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA模板，引物和探针则与模板上的序列配坷阳特异性结合，当PR击增延伸到探针结合部位时，Taq DNA聚合酶将探针水解成单核昔酸，使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实时检测(荧光探针法。由于初始模板
8、量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测阔值时所经历的Ct值不同，因此Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量。6 实验室设置参照GB/T19495. 2。实验室应至少分为三个相对独立的工作区域:样本制备区、反应试剂配制区和检测区;每个工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。7 主要仪器设备和试剂7. 1 仪器设备7. 1. 1 实时荧光PCR仪。7.1.2 高速台式离心机。7. 1. 3 生物安全柜或超净工作台。7. 1. 4 冰箱(冷藏室40C和冷冻室一200C)。7. 1. 5 涡旋混匀仪。7. 1. 6 紫外灭菌灯。7. 1. 7 微量可调移液器(0.5L10L、10
9、L100L，100Ll000L)。7. 1.8 带滤芯Tip头。7.1.9 PCR反应管(0.2mL八联管)。7. 1. 10 微滤柱。7. 1. 11 高压灭菌锅。7.2 试剂7.2. 1 次氯酸铀(NaCI03)。7.2.2 十二皖基硫酸铀(SDS)。7.2.3 蛋白酶K(Proteinase K)。7.2.4 三是甲基氨基甲烧(Tris)。7.2.5 乙二胶四乙酸(EDTA)。7.2.6 盐酸脏(GuanidingeHCl )。7.2.7 元水乙醇(ethanol)。7.2.8 实时荧光PCR混合试剂(Real-timePCR Master Mix)。8 取样及样晶处理8. 1 取样用具
10、8. 1. 1 样品袋:牛皮纸袋或信封(一次性使用)。8. 1.2 枝剪。8. 1.3 剪刀，慑子，打孔器。8. 1.4 研钵。8. 1.5 塑料离心管(1.5 mL)。G/T 28062-2011 8. 1. 28. 1. 5的取(制)样用工具应经121.C士2.C , 15 min高压蒸汽灭菌。田间采样每个样品采集后或实验室处理每个不同样品后，工具应用70%酒精棉球擦拭2次以上，以避免样品间相互污染。8.2 取样方法8.2. 1 实地取样产地检疫田间实地取样参照GB5040。8.2.2 叶片样晶疑似病树按树冠东南西北四方采集，每点取中下部成熟叶片各5片，每棵树共采集叶片20张。种苗抽取显现
11、疑似症状植株或随机抽取植株(元症材料)10株，每株取中下部成熟叶片5片，共50片。接穗等繁殖材料按规程规定的比例抽取样品。黄龙病病害症状及疑似症状详参见附录D。8.2.3 果实样晶幼果期采样，切取果柄和果蒂，每样品采集4份F商品鲜果每批果实随机抽取10个果实，切取果柄和果蒂。3 GBjT 28062-2011 8.2.4 传病媒介柑桔木虱在柑桔新梢抽发期，每株树采集1头10头成虫，每园采集50头以上;口岸或调运种苗、接穗等材料中发现的木虱则直接收集。用75%乙醇浸泡固定30mino放入1.5 mL离心管封装。样品采集后立即装入样品袋(木虱用75%乙薛杀死固定后装入微量离心管)，并按照要求填写采
12、样记录，记载样品来源、样品品种、目测症状、采样人、采样地、采样时间等，及时送指定检测实验室。8.3 样晶贮运与保存采集的植株样品按上面要求用样品袋分装，乙醇固定的柑桔木虱控干乙醇后用塑料离心管分装，与采集记录一并寄送指定实验室检测。检测后余下的植物材料可置于40C条件下保存7d，以备复测的需要。不需保存的样品应立即进行元害化灭菌处理以防止病害扩散。8.4 样晶DNA制备操作(在检测实验室样品制备区进行)样品DNA制备在检测实验室样品制备区进行。制备好的DNA样本在40C条件下保存应不超过7 d，在一200C冻存不超过30d，避免反复冻融。样品DNA制备的具体操作过程见附录E。9 PCR扩增PC
13、R扩增反应体系为25L准备PCR扩增反应管，分别加入反应液23L，最后加入制备的待测样品DNA2L。每个样品设置3次重复。每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。扩增过程中，设置在每次循环的延伸阶段采集荧光。荧光染料法检测须在扩增结束后立即进行熔解曲线分析，以验证扩增的特异性。熔解曲线的反应程序为:95oC ,1 min; 55 oC , 1 min;然后从55.C开始每升高0.5.C保持10s，连续升高80次(到95.C 为止)。检测结束后，根据采集的荧光曲线和Ct值判定结果。PCR扩增的准备及扩增具体操作过程见附录F(使用不同PCR仪具体扩增程序参数可能稍有调整)。推荐使用
14、柑桔黄龙病菌亚洲种实时荧光PCR检测试剂盒。试剂盒组成、功能及使用注意事项参见附录G。10 结果判定与表述10.1 结果分析条件设定直接读取检测结果。检测阔值设定应根据仪器噪声情况进行调整，以阔值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。10.2 质控标准10.2. 1 阴性对照及空白对照应无Ct值并且元扩增曲线。否则，此次检测视为元效。10.2.2 阳性对照的Ct值应28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次检测视为无效。GB/T 28062-2011 10.3 结果判定10.3. 1 阴性反应测试样品检测Ct值二三40或者无Ct值并且无扩增曲线，且阴性对照、阳性对照、空白对照结果正常，判
15、定该样品为阴性，表示该样品中不带可检出的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌。10.3.2 阳性反应荧光探针法检测时，样品Ct值35，出现典型的扩增曲线，且阴性对照、阳性对照、空白对照结果正常，判定该样品为阳性，表示该样品中存在柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌。荧光染料法检测时，Ct值35，出现典型的扩增曲线，且阴性对照、阳性对照、空白对照结果正常;熔解曲线为单峰，并且熔解曲线与预期目标扩增产物熔解曲线一致，或熔解曲线出现双峰，其中一个峰为引物二聚体，另一个峰的熔解曲线与预期目标产物熔解曲线一致，则判定该样品为阳性，表示该样品中存在柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌。10.3.3 特殊情况实时荧光PCR检测样品Ct值大于35的样
16、品但小于40，建议用同一样品模板量加倍(相应减少加入灭菌超纯水量)进行实时荧光PCR复测。复测的结果按上述判定标准判定是否带柑桔黄龙病菌;如果Ct值仍大于35，判定为阴性。5 GB/T 28062-2011 附录A(资料性附录)柑桔黄龙病菌其他信息A.1 寄主及分布主要分布在亚洲地区的印度、日本、菲律宾等东南亚国家以及中国的部分地区。寄主为柑桔类植物，柑桔属、金柑属和权属植物受害严重。也可低度浸染芸香科的九里香、黄皮，特殊情况下也可侵染长春花等非芸香科植物。A.2 传播方式带菌种苗、接穗及其上附着的传播媒介昆虫柑桔木虱CDiaphorinacitri Kuwayamd)是远距离传播的主要途径，
17、田间则主要由柑桔木虱取食传播以及嫁接传播。6 附录B(资料性附录)柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌常规PCR检测(Hocquellet，1999) B.1 采样及样晶制备同柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌PCR检测。B.2 PCR扩增B. 2.1 引物名称及序列Laf A2 , 5-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3 Laf J5: 5-ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3 B. 2. 2 PCR反应体系GB/T 28062-20门PCR反应体积为每管25Lo25L的反应体系中含有终浓度为lXPCR缓冲液、1mol/L引物对Laf A2/Laf J5(序列见B.2.1)以及适量
18、模板进行PCR扩增。预期扩增片段大小为669bpo B. 2. 3 PCR反应程序预变性94.C/5 min;然后92.C变性20s , 62 .C退火20s , 72 .C延伸45s共35个循环;72 .C延伸7 min, 4 .C保温。PCR扩增结束后，以2%的琼脂糖凝肢电泳，然后通过紫外成像系统成像。保存成像图片作为结果判定依据。B.3 结果判定与描述B. 3. 1 质控标准扩增结果经电泳在阴性对照和空白对照泳道无扩增条带，阳性对照泳道有669bp大小的预期片段，结果视为有效。否则检测无效，应重新进行检测。B. 3. 2 阴性反应在电泳图片中样品泳道不出现669bp大小的预期扩增片段，阴
19、性对照、阳性对照和空白对照正常，判定为阴性，表示样品中元可检出的柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌。B. 3. 3 阳性反应在电泳图片中样品泳道有669bp大小的预期扩增片段，阴性对照、阳性对照和空白对照正常，判定为阳性，表示样品中存在柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌。7 G/T 28062-2011 附录C(资料性附录)柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌实时荧光PCR检测C.1 采样及样晶制备同柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌实时荧光PCR检测。C.2 PCR扩增C.2.1 引物和探针(依据美洲韧皮杆菌16SrRNA基因特异序列设计的引物对及探针)C. 2. 1. 1 引物名称及序到HLBLamF: 5 -GAGCGAGTACGCAA
20、GTACT AG-3 HLBLamR: 5 -GCG TT A TCCCGT AG AAAAAGGT AG-3 C. 2. 1. 2 探针名称及序列HLBLamP: 5 F AM/ AGACGGGTGAGT AACGCG/BHQ-3 C. 2. 2 PCR反应体系PCR反应体积为每管25Lo25L的反应体系中含有终浓度为1X PCR Master Mix、0.6mol/L引物对HLBLamF/HLBLam R、探针HLBLamP O. 3 flmol/L以及适量模板。C. 2. 3 PCR反应程序预变性95oC/20 s;然后95oC变性1s , 58 oC退火40s，共40个循环，仪器设置在
21、每个循环的退火延伸阶段自动采集荧光。验证检测结束后，根据采集的荧光曲线和Ct值判定结果。C.3 结果判定C.3.1 结果分析条件设定直接读取检测结果。阔值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阔值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。C.3.2 质控标准C. 3. 2.1 阴性对照和空白对照元Ct值并且无扩增曲线。检测结果有效，否则此次实验视为元效。C.3.2.2 阳性对照的Ct值28，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。C.3.3 结果判定及描述C. 3. 3.1 阴性反应样品元Ct值并且无扩增曲线，且阳性对照、阴性对照和空白对照结果正常，判定为阴性，表示样品中元可检出的柑桔黄
22、龙病美洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibacter americanus , Lam)。8 GB/T 28062-20门C.3.3.2 阳性反应Ct值35，并出现典型的扩增曲线，且阳性对照、阴性对照和空白对照结果正常，判定为阳性，表示样品中存在柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibacter americanus, Lam)。C.3.3.3 其他情况若实时荧光PCR检测的Ct值大于35，建议同一样品加大样品量(加倍)重新进行荧光PCR。复测的结果按上述标准判定，若Ct值仍大于35，判定为阴性。9 GB/T 28062-2011 附录D(资料性附录)柑桔黄龙病的症
23、状鉴定D.1 柑桔黄龙病症状D. 1. 1 叶片症状(固D.1)当年抽生的春梢叶片转绿后，沿叶脉附近、叶片基部或边缘不均匀的黄化，形成黄绿相间的斑驳症状。而柑桔叶片缺铮、缺锺症状的黄化沿叶脉间均匀分布。图D.1柑桔黄龙病叶片初期斑驳症状D. 1.2 枝梢症状(圄D.2)夏秋梢:5月8月抽生的夏梢与8月10月抽生的秋梢症状表现基本相同，病梢一般出现在树冠顶部，多数仅1梢2梢或少数几梢出现。感病的夏秋梢在叶片老熟过程中往往叶脉先变黄，随后叶肉由淡黄绿变成黄色，均匀黄化，形成黄梢。当年感病的黄梢落叶成秃枝，翌年春季重新萌发的新梢短而纤弱，叶片窄小。固D.2柑桔树冠黄梢症状D. 1.3 果实症状(图D
24、.3，图D.4)柑桔病果外形变小、畸形，果内维管呈黄褐色(正常果实维管束为绿白色)，种子变褐败育，有的品种病果可以形成下部青色，上部橙红色的红鼻果。G/T 28062-2011 圄D.3柑桔黄龙病芦柑红鼻果病果图D.4柑桔黄龙病病果剖面不对称症状D.2 柑桔黄龙病鉴定步骤D.2.1 通过症状鉴定D. 2. 1. 1 叶片斑驳:首先观察中脉基部及叶脉附近是否有不均匀分布的黄化病斑，再看叶缘是否有黄化病斑。黄龙病所致黄化病斑呈浅黄色，与周围绿色叶肉分界不如缺铮症状明显，而缺锺引起的黄化通常分布均匀。D. 2. 1. 2 树冠黄梢:病树上部个别枝梢叶片黄化，叶脉变黄，叶片发脆。若天牛为害则枝梢叶片中
25、脉均匀黄化或全树黄化。D. 2.1.3 果实畸形:病树果实畸形、变小，歪斜，果皮内维管黄褐色(键果维管束绿白色)，果实种子败育。D.2.2 通过柑桔木虱鉴定柑桔木虱为同翅目的木虱科昆虫，传播亚洲韧皮部杆菌的为亚洲柑桔木虱，传播非洲柑桔韧皮部杆菌的为非洲二点木虱(柑桔木虱见图D.5)。A A卵;B一一若虫;C一一成虫。a) 亚洲柑桔木虱图D.5司3A 柑桔木虱b) 非洲二点木虱柑桔木虱成虫吸食嫩梢状见图D.6，柑桔木虱若虫取食及分泌蜜露见图D.7。11 GB/T 28062-2011 图D.6柑桔木虱成虫吸食撤梢状图D.7柑桔木虱若虫取食及分油蜜露12 GB/T 28062-20门附录E(规范性
26、附录)样晶处理试荆配制及样晶DNA提取E.1 样晶处理试剂配制除非特殊说明，本标准所有样品制备试剂均用元菌容器分装，常温保存备用。E. 1. 1 TES缓冲液(pH8.0): 10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA, 1% SDS, 121 .C高压灭菌20 min。E. 1. 2 TE缓冲液(pH8.0) :10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA, 121 .C高压灭菌20min. E. 1.3 蛋白质变性剂:7 mol/L Guanidinge HCl (盐酸服)。E. 1. 4 10 mg/ml蛋白酶K，一20.C冰箱保存。E.2 样晶
27、DNA提取E. 2.1 工作台及操作者消毒灭菌:样品处理在超净工作台或生物安全柜中进行;工作台和操作者双手应消毒灭菌。E.2.2 待测柑桔组织样品或柑桔木虱DNA制备E. 2. 2. 1 将柑桔叶片或果实用清水洗净，吸水纸擦干，撕取叶片中脉或果柄、果蒂，放于研钵中，加人液氮研成粉末，或直接用剪刀剪碎(每一样品处理换干净研钵，剪刀用后以医用酒精擦拭并用火焰灼烧防止交叉污染)，取约200mg碎屑装入1.5 mL离心管中;或取柑桔木虱5头，装人1.5 mL离心管中，用Tip头尖捣碎。E. 2. 2. 2 离心管中加入800f.1-LTES缓冲液65c水浴中预热10min和10L的蛋白酶K液(10g/
28、L)，混合均匀后置于65.C水浴1h，其间振荡2次。E.2.2.3 吸取上清液转入1.5 mL离心管，按照1: 2的比例加入蛋白质变性剂，混合均匀后，在室温下放置10min. E. 2. 2. 4 10000 g离心10min后，吸取上清液加入微滤柱中，10000g离心1min，弃滤过液，E.2.2.5 向微滤柱中加入15%乙醇750L，10000g离心洗涤1min，弃滤过液。如微滤柱滤膜上有黄褐色沉淀，应再加75%乙醇重复洗法直到洗去黄褐色沉淀qE. 2. 2. 6 10000 g离心1min以除去残余乙醇。E. 2. 2. 7 向柱中加入50LTE缓冲液，10000g离心1min，收集洗脱
29、液约40L，即为后续PCR步骤中的待测样品模板。E.2.3 阳性对照:按照上述方法提取确诊的柑桔黄龙病典型斑驳叶片中脉DNA或以浓度为0.44 pg/L的病菌特异DNA序列元害化重组质粒DNA作为阳性对照(推荐)。E.2.4 阴性对照z按照上述方法提取健康的柑桔成熟叶片中脉DNA作为阴性对照。13 GB/T 28062-20门附录F(规范性附录)检测试剂配制及实时荧光PCR检测F. 1 扩增试剂配制(在反应试剂配制区进行)F. 1. 1 用元菌超纯水配制25mol/L亚洲韧皮杆菌特异性引物对CQULasF 03/CQULas R 03母液(用于荧光染料法，引物序列为5人CAAGGAAAGAGC
30、GTAGAA-3 /5-CCTCAAGATCG GGTA AA G-3，扩增柑桔黄龙病菌亚洲种rplJ/rplL特异基因序列片段为382bp)。F. 1.2 以无菌超纯水配制25fLmol/L亚洲韧皮杆菌特异性引物对CQULasF04/ CQ ULasF04母液:(用于荧光探针法，序列为5-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3 /5人CCAACGAAAAGATCA GATATTCCTCTA-3，扩增柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌rl/rplL特异基因靶序列片段为87bp)。F. 1. 3 以元菌超纯水配制25mol/L荧光标记探针CQULasPl母液(序列为5人ATCGTCTCGTCAAG
31、ATTGC TA TCCGTGATACTAG-3)。F.2 加样(在反应试剂配制区进行)F. 2.1 方法1试剂盒方法(推荐方法)从固相化试剂盒中取出0.2mLPCR固相化试剂检测管，管中分别加入23L样品恢复液，再在不同管中分别加入2L待测样品DNA液、阳性对照、阴性对照、空白对照(灭菌超纯水)，盖紧管盖，转移至PCR反应区。F.2.2 方法2自配试剂方法F. 2. 2.1 荧光染料法(反应体系为25L)F. 2. 2. 1. 1 加入引物对CQULasF03/CQULas R03母液到实时荧光PCRMaster Mix中，加入适量灭菌超纯水，使反应液中引物终浓度为各0.3mol/L，lX
32、PCR Master Mix，振荡?昆匀。F. 2. 2. 1. 2 取0.2mL PCR反应管，编号后每管中加入23L上步所配反应液。F. 2. 2. 1. 3 反应管中分别加入待测样品DNA液2L/每管;以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白对照2L/每管代替待测样品设置对照，盖紧试管盖，3000g瞬时离心，以混匀并去除气泡。F. 2. 2.1.4 转移至PCR检测区。F.2.2.2 荧光探针法(反应体系为25L)F. 2. 2. 2. 1 在避光条件下加入引物母液CQULasF04/CQULasR04和荧光标记探针CQULasPl母液到实时荧光PCRMaster Mix中，加入适量灭菌超纯
33、水，使反应液中引物对终浓度为各O.3mol/L， 探针浓度为0.3mol/L，lXPCRMaster Mix，振荡混匀。F.2.2.2.2 取0.2mL PCR反应管，编号后每管中加入23L上步所配反应液。F.2.2.2.3 分别加入待测样品DNA液2L/每管;以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白对照(灭菌超纯水)2L/每管代替待测模板设置对照，盖紧试管盖，3000g瞬时离心，以混匀并去除气泡。F.2.2.2.4 转移至PCR检测区。F.3 实时荧光PCR检测(在检测区进行)设置好各反应管在实时荧光PCR仪上的孔位并做好标记记录，按照预设孔位将各检测样品及对照放入荧光PCR仪内进行PCR扩增。
34、F.3.1 荧光染料法PCR扩增F. 3.1. 1 扩增程序GB/T 28062-2011 在iCycler(Bio-Rad，USA)实时荧光PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号PCR仪扩增程序参数可能稍有变化): 一-94 oC预变性5min; 一-950C变性5s，然后59c退火15s，720C延伸45s，共40个循环z设置在每个循环的延伸阶段自动采集荧光;一二末次延伸720C，7m口旧mF. 3. 1. 2 熔解曲线分析PCR扩增结束后立即进行熔解曲线分析，以验证扩增的特异性。熔解曲线的反应程序为:95 oC , 1 min; 55 oC , 1 min;然后从550C开始每升高0.50
35、C保持10s，连续升高80次(到95c为止)。验证检测结束后，设备自动记录并生成报告。根据采集的荧光曲线和Ct值判定结果。F.3.2 荧光探针法扩增程序在iCycler(Bio-Rad，USA)实时荧光PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号PCR仪扩增程序参数可能稍有变化): 一一预扩增95oC ,1 min; 95 oC , 15 s , 59 oC , 15 s , 72 oC , 45 s，40个循环;在每个循环延伸阶段(720C)同步采集荧光;末次延伸72oC , 7 mino 检测结束后，根据采集的荧光曲线和Ct值判定结果。15 GB/T 28062-20门附录G(资料性附录)柑桔黄龙
36、病菌亚洲种实时荧光PCR检测试剂盒组成及使用说明G.l 试荆盒组成每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分:样品制备液I样品制备液E样品制备液E阴性对照(健康柑桔叶片DNA)阳性对照(柑桔黄龙病菌亚洲种重组质粒DNA)固相化试剂检测管恢复液G.2 试剂盒说明50 mLX1瓶10 mLX5管20 mLX 1瓶100 ng/管X2管100 ng/管X2管八联管X6条10 mLX 5管G. 2.1 样品制备液1:主要成分为三起甲基氨基甲皖CTris)、乙二股四乙酸CEDTA)和十二皖基磺酸铀CSDS) ，外观为无色液体，常温保存时可能有絮状沉淀，使用前应在65.C下水浴加热溶解沉淀。使用前按说明书要求
37、加入蛋白酶K水溶液。G.2.2 制备液皿第一次使用时应按包装上注明的剂量加入元水乙醇，然后常温密闭保存备用，可保存2个月。G.2.3 恢复液用于溶解荧光PCR固相化混合试剂。G.2.4 用于荧光染料法检测的固相试剂检测管中包含除待测样品DNA外的所有PCR扩增反应试剂及荧光染料，用于荧光探针检测的固相化试剂检测管中包含除待测模板DNA外的所有PCR反应试剂及荧光探针。G.3 功能所列试剂盒可用于柑桔黄龙病叶片和果实等组织样品中柑桔黄龙病菌亚洲种的实时荧光PCR检测和病害鉴定。若需检测样品带菌量，则样品和阳性对照都需要定量。具体操作按使用说明进行。16 GB/T 28062-2011 G.4 试
38、剂盒使用注意事项G.4.1 发生褐变的柑桔组织材料不可用作PCR检测的样品。G.4.2 在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染，所有用具应彻底清洗并消毒。移液器头尖应一次性使用，并且转移每个样品时都应更换。G. 4. 3 全部检测过程可在室温(23.C)下进行。试剂盒可以在室温条件下置于干燥器内密封保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。17 -FON|NONH阁。华人民共和国家标准柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法GB/T 28062-2011 国由导中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1.5字数33千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷* 书号:155066. 1-44586定价24.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28062-2011 打印日期:2012年5月22日F002
