1、ICS 65.020.01 B 16 道B中华人民共和国国家标准GB/T 28063-2011 菜豆芙斑驳病毒检疫鉴定方法Detection and identification of bean pod mottle virus 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布G/T 28063-2011 目。吕本标准按照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SACjTC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中
2、华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:廖富荣、沈建国、郑耘、陈青、林石明、陈红运、黄蓬英、吴援。I GB/T 28063-2011 菜豆芙斑驳病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了菜豆英斑驳病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于可能携带该病毒的豆科作物的种子、苗木等植物繁殖材料的检测鉴定，也适用于传播该病毒介体昆虫的检测鉴定。2 菜豆英斑驳病毒基本信息中文名:菜豆英斑驳病毒。英文名:bean pod mottle virus。异名:bean pod mottle comovirus (菜豆英斑驳病毒), pod mottle virus (英斑驳病毒)，desmodiu
3、m virus(金钱草病毒)。英文缩写:BPMV。属旺豆花叶病毒科Comoviridae、虹豆花叶病毒属Comoviruso菜豆夹斑驳病毒的其他信息参见附录A。3 方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、反转录和体外DNA扩增技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定。4 主要仪器设备本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备:微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001g)、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计和各种量程的可调移液器(1000L、200L、100L、20L、2L)。
4、5 检测样品的制备5. 1 DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测样晶的制备对每批送检样品进行症状检查，优先选取具有褐色或黑色斑驳症状的种子(从种脐开始)，或者选取具有斑驳、皱缩、褪绿等症状的叶片。种子样品:称取o.5 g1. 0 g的种皮作为检测样品，在液氮中充分研磨，回温后按1: 10比例加入样品提取缓冲液继续研磨。叶片样品:称取o.5 g1. 0 g的叶片作为检测样品，在研钵中研磨或在液氮中研磨，按1: 10比例加入样品提取缓冲液继续研磨。把研磨后的样品转移到5mL离心管中，8000 r/min离心5min，上清液作为DAS-ELISA(见附录B)和IC-RT-PCR(见附录。检测提
5、取液。注=提取液在3h内使用，否则保存在4.C中。GB/T 28063-2011 5.2 RT-PCR检测样品的制备称取表现症状的0.1g叶片、种子等样品在液氮中充分研磨后，利用TRlzol方法提取RNAo(见附录D中的D.3)6 检测与鉴定6. 1 检测鉴定流程通常，初筛时采用DAS-ELISA检测方法。当DAS-ELISA产生阳性结果时，再采用IC-RT-PCR或RT-PCR等方法进行验证。当首先采用IC-RT-PCR或RT-PCR方法检测时，如果产生阳性结果，则通过实时荧光RT-PCR方法或序列测定等方法验证。6. 2 DAS-ELISA检测把制备的样品上清液加入巳包被BPMV抗体的在9
6、6微孔板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品平行加到两个孔中。用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照，用样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如t种子或叶片)应该尽量与所检测样品相一致。具体操作过程见附录Bo6.3 RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录D。6.4 IC-RT-PCR检测把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的离心管中，然后进行RTPCR扩增。用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物
7、组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录C。6.5 序列测定将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核昔酸序列翻译成氨基酸后与己知的BPMV相应序列进行比对，如果与已知的BPMV相应序列同源性大于75%则判定为BPMV序列，同源性小于75%则判定为非BPMV序列。注2序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http:/www.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 7 结果判定与报告7. 1 结果判定2 当产生以下检测结果时，则判定为检出BPMV:当DAS-ELISA检测、IC-RT-PCR(或RT-PC
8、R)检测、其中两种方法的检测结果呈阳性时，则判定为检出BPMV;G/T 28063-2011 一一当IC-RT-PCR或RT-PCR检测结果呈阳性，测定的序列为BPMV序列时，则判定为检出BPMVo 7.2 结果记录与保存记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结果保存吸光值的数据报告，IC-RT-PCR或RT-PCR检测结果保存电泳照片，序列测定结果保存测序报告图。3 G/T 28063-2011 A.1 分布地区北美洲:美国、加拿大。南美洲z巴西、厄瓜多尔、秘鲁。亚洲:伊朗。A.2 形态特征附录A(资料性附录)菜豆英斑驳病毒简介病毒粒子形态
9、为等轴对称二十面体，无包膜，直径为28nm。A.3 寄主范围及症状BPMV的寄主局限于豆科植物，主要是大豆CGlycinemax)和菜豆CPhaseolus spp.)，山蚂脯CDesmodium paniculatum)是其多年生寄主。在鉴别寄主植物上的症状:大豆CGlycinemax):表现为严重的系统症状，叶片斑驳、皱缩、英和种子斑驳，甚至坏死、植株死亡。该病毒还能延迟大豆茎杆成熟，引起绿茎现象。在种子上产生褐色、黑色的斑驳症状，症状从种脐开始，因而称为种脐渗色。菜豆CPhaseolusvulgaris) Tendergreen品种:起初出现褪绿斑，后发展为严重的系统褪绿，叶片畸形，豆英
10、严重斑驳、深绿色、豆英变短、畸形、扭曲、变得粗糙有疵状突起。菜豆CP.vulgaris) Pinto品种:元系统症状，接种后约3d4 d出现散生的红色局部枯斑，接种叶有时叶脉坏死。菜豆CP.vulgaris) Bountiful品种:元系统症状，接种后约3d4 d出现大的淡黄色局部病斑。A.4 传播途径BPMV可以通过昆虫介体传播，主要是大豆叶甲(Cerotomatrifurcata) ，而玉米根叶甲CDiabrotica virgifera)、带斑黄瓜叶甲CD.balteata)、点斑黄瓜叶甲CD.undecim户unctatahowardii)、葡萄甲虫CColasis flavida)、
11、甲虫CC.lata)、曲条豆芫菁CEpicauta臼ttata)、墨西哥叶甲CEpilachna varivestis)和大豆潜叶虫COdontotahorni XenochalehorniJ)也是该病毒的传播介体。该病毒另外还可以机械传播，嫁接传播，以及通过种子进行远距离传播。从感染BPMV植株上收获的种子，其种传率为0.10%，种传率相对较低。与大豆花叶病毒CSoybean mosaic virus , SMV)一起感染，种传率可以达到39%。A.5 血清学特性BPMV具有很强的免疫原性，制备的多克隆抗体可以检测大豆叶片、种子、草本寄主植物和介体昆虫中的病毒。4 GB/T 28063-20
12、门.6 分子生物学特性BPMV是正链RNA病毒，其基因组由两条正链RNA-l(约3.6kb)和RNA-2(约6.0kb)组成，分别包裹在两个直径为28nm的等轴多面体粒体中。RNA-l编码5个复制所需的蛋白，RNA-2编码一个推导的细胞间运动蛋白和两个外壳蛋白。.7 ，豆花叶病毒属种间区分依据. 7.1 大外壳蛋白(Largecoat protein , LC凹的氨基酸序列同源性小于75%。.7.2 聚合蛋白酶的氨基酸序列同源性小于75%。.7.3 在可能的成分间没有假重组。. 7. 4 抗原反应有差异。5 GB/T 28063-2011 附录B(规范性附录)DAS-ELlSA检测操作步骤B.
13、 1 DAS-ELISA所采用的试剂B. 1. 1 包被缓冲液CpH9.6)碳酸铀CNaZC03)1. 59 g 碳酸氢铀CNaHC03)2.93 g 叠氮化铀CNaN3)0.20 g 加入900mL蒸锢水溶解，用HCl调节pH值到9.6，然后加水至1L。B. 1.2 磷酸盐缓冲液CP邸，pH7.4)氯化铀CNaCl)8.0 g 磷酸二氢饵CKHzP04)0.2 g 磷酸氢二铀(NazHP04)1. 15g 氯化饵(KCl)0.2 g 叠氮化铀(NaN3)0.2 g 加入900mL蒸锢水溶解，用NaOH或HCl调节pH值到7.4，然后加水至1L。B. 1. 3 PBST 每升PBS中加入0.5
14、mL的Twee仔细。B. 1.4 样晶提取缓冲撞(pH7.4)PBST + 2 % PVP (PVP-40聚乙烯基毗咯皖酣)。B. 1.5 酶标抗体稀释缓冲液PBST+2% PVP+O. 2%卵白蛋白。B. 1.6 底物缓冲渣二乙醇胶蒸馆水97 mL 600 mL 叠氮化铀(NaN3)0.2 g 用HCl调整pH至9.8，然后加HzO到1L。注:缓冲液可以储存在4C -IO C中至少2个月，使用前回温至室温。B. 1.7 抗体BPMV包被抗体、碱性磷酸酶标记的BPMV抗体。6 GB/T 28063-2011 B.2 操作步骤B. 2.1 包被根据检测试剂盒说明，用包被缓冲液稀释BPMV抗体(如
15、1: 200)，在微孔板中每孔加入100L包被抗体溶液。在室温下孵育2h4h或4oc下包被过夜。B.2.2 捕获抗原倒去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗4次5次孔(可在洗板机上完成)。加入100L检测样品提取液到酶标板的孔中，每个样品至少两个孔。并设置阳性和阴性对照。在室温下孵育2h或4oc下过夜。B.2.3 加入酶标抗体根据试剂盒说明，用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如1: 200)。倒去孔中的检测样品提取液，用PBST洗4次5次孔(可在洗板机上完成)。每孔加入100L酶标抗体溶液。在室温下孵育2 h。B.2.4 加廊物用底物缓冲液把对硝基苯磷酸二铀盐(p-NitrophenylPhos
16、phate , pNPP)配制成1mg/mL的底物溶液。倒去酶标抗体溶液，用PBST洗4次5次孔(可在洗板机上完成)。每孔加入100L新鲜配制的底物溶破。室温下避光放置(约30min60 min) ，至阳性对照孔明显显色。B.2.5 眼光值的测定用酶标仪在405nm处读取吸光值。B.2.6 结果判定通过酶标仪上405nm的OD值来判定。对照孔的OD405值(缓冲液孔、阴性对照及用性对照孔)，应该在质量控制范围内，即:缓冲液孔和阴性对照孔的OD4Q5值2，判为阳性f一一样品OD4Q5值/阴性对照OD405值明显2，判为阴性;一样品OD4Q5值/阴性对照OD4Q5值在阔值附近，判为可疑样品，需重新
17、做一次，或用其他方法加以验证。7 GB/T 28063-2011 附录C(规范性附录)IC-RT-PCR检测操作步骤C.1 主要试剂BPMV抗体、包被缓冲液和PBST试剂见B.1;RT-PCR试剂见D.1。C.2 包被抗体根据检测试剂说明，将包被抗体用包被缓冲液稀释(如1:200)，取50L100L稀释好的包被溶液于0.6mL的离心管中。25oC中放置3h或4oC冰箱中过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次5次，去除残留溶液。C.3 抗原捕捉向每个已包被抗体的离心管中加入检测样品上清液100L，25oC下放置2h3 h或4oC冰箱中放置过夜才日入PBST缓冲液洗涤3次5次，双蒸水洗涤1次，去除残留
18、溶液。注:如果是用于验证DAS-ELISA的检测结果，可直接使用血清学检测样品的剩余提取液。C.4 cDNA合成在上述离心管中加入1L的BPM4引物(10mol/L)、37.5L的ddHzO(经DEPC处理)，于95 oC的水浴中处理7min，然后迅速冰浴5min;继续加入5XRT缓冲液10L、10mmol/L的dNTP混合物O.5L、M-MLV反转录酶0.5L、RNaseInhibitor O. 5L;然后37oC水浴1h，950C水浴10 min，冷却后作为PCR扩增模板。C.5 PCR扩增在25L的反应体系中:2. 5L的10X PCR buffer (含20mmol/L的MgZ十)，d
19、NTP(每种各10 mmol/L) O. 5L， Taq DNA聚合酶(2.5 U/L) 0.5L， BPM3和BPM4引物(10mol/L)各1.0L(引物见表D.1)，加人上述DNA模板10L，ddHzO补足体积。与D.5反应程序相同，反应完成后，取5L扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后用EB染色，在凝胶成像系统上观察。C.6 结果判定8 阴性对照和空白对照没有产生条带、阳性对照产生预期大小(约228bp)的条带情况下:如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，则为阳性;一二如果检测样品未出现与阳性对照大小一致的条带，则为阴性。GB/T 28063-2011 附录D(规范性附录
20、)RT-PCR检测操作步骤D.1 主要试剂D. 1. 1 RNA提取试剂TRlzol reagent、三氯甲:皖、异丙醇、70%乙醇。D. 1.2 反转录试剂M-岛1LV反转录酶(200U/L)、5X反应缓冲液(250mmol/L古is-HClpH8. 3 25 oC、375mmol/L KCl、15mmol/L MgClz , 50 mmol/L DTT)、dNTP混合液(各10mmol/L)、RNaseInhibitor (40 U/L)。D. 1. 3 PCR试剂10XPCR缓冲液(含15mmol/L的MgH)、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液(各10mmol/L)。D.2 引物序到本
21、方法的特异性引物序列见表D.1。其中BPM3为正向引物，BPM4为反向引物，扩增区域在大外壳蛋白基因上，扩增大小为228bp。引物由生物公司合成与纯化。表D.1所使用的引物序列引物名称引物序列在NC_003495a上的位置BPM3 5 -CAT AGCA TTTGGAAA TTTGGCTG-3 2 587-2 609 BPM4 5-TCACCTGGTATTGTRGACAC-3b 2 795-2 814 注:也可以采用根据BPMV基因组序列合成的其他特异性引物。a在GenBank上的基因序列登录号。b序列中的R=G或A。D.3 总RNA的提取取O.05 gO. 1 g样品，加入1mL TRlzo
22、l reagent充分研磨，室温放置5min; 12000 g离心5min, 取上清液到另一离心管中;加入三氯甲烧200L，充分振荡15s，室温放置3min; 12 000 g ,4 oC离心15 min;取上层水相加入另一离心管中，加入0.5mL异丙脖;12000g ,4 oC，离心10min，弃去上清液;加入1mL 70%乙醇洗涤;RNA沉淀干燥后，加经过焦碳酸二乙醋(DEPC)处理的ddHzO40L溶解即可。注:本方法是根据TRlzolreagent方法提取总RNA，在保证总RNA质量的情况下，也可以采用其他总RNA提取方法。9 GB/T 28063-2011 D.4 cDNA合成在3L
23、的总RNA中加入1L的BPM4引物(10mol/L)，于950C的水浴中7min，然后迅速冰浴5min。继续加入5X反应缓冲液2.5 JlL、dNTP混合物(10mmol/L) O. 5L、M-MLV反转录酶(200 U/L) O. 5L、RNaseInhibitor O. 5L、经DEPC处理的ddH204.5L。然后370C水浴1h , 95 oC水浴10min，自然冷却至室温，一20oC冰箱中保存。D.5 PCR扩增以上述合成的cDNA为模板，进行PCR扩增。在PCR的薄壁管中分别加入以下试剂(25L体系):10XPCR缓冲液(含20mmol/L的Mg2+)2.5L、TaqDNA聚合酶(
24、2.5U/L) 0.5L、dNTP混合物(每种各含10mmol/L) O. 5L、BPM3引物(10mol/L)1. 0L、BPM4引物(10mol/L)1.0L、cDNA3.0L、ddH2016.5Lo 反应条件:940C预变性3min，然后940C变性50s、600C退火50s、720C延伸30s，进行35个循环，最后一个循环结束后72oC继续延伸7min D.6 琼脂糖凝胶电泳RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。每个样品取5L的RT-PCR产物与1L的6X上样缓冲液混合均匀，并加到置于0.5XTBE缓冲液的1.5%琼脂糖凝肢孔中，然后在120V下电泳。电泳结束后，放入装有0.5
25、g/L的澳化乙链(EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，在凝胶成像系统中观察，拍照，并保存照片。D.7 结果判定在阴性对照和空白对照没有产生条带、阳性对照产生预期大小(约228bp)的条带情况下:一一如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，则为阳性;一一如果检测样品未出现与阳性对照大小一致的条带，则为阴性。10 FFONlt的ONH阁。华人民共和国家标准菜豆英斑驳病毒检瘟鉴定方法GB/T 28063-2011 国中争e中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数19千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷* 18.00 JG 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价书号:155066 1-44585 GB/T 28063-2011 打印H期:2012年4月19H F002A
