1、ICS 65.020.01 B 16 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 28065-201 1 地中海实蝇生物芯片检测方法Biochip detection of Ceratitis ca pitata (Wiedemann) 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准地中海实蝇生物芯片检测方法GB/T 28065-2011 * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室，(010)64275323发行中心，(01
2、0)51780235读者服务部，(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张0.75字数15千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷导书号，155066. 1-41583定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107G/T 28065-2011 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局，本元正阳基
3、因有限公司、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:余道坚、李建光、任鲁风、徐浪、周琦、章桂明、陈枝楠、汪万春、康林、仲建忠、向才玉。I G/T 28065-2011 地中海实蝇生物芯片检测方法1 范围本标准确定了地中海实蝇Ceratitiscaitata CWiedemann) C双翅目Diptera实蝇科Tephritidae)的生物芯片制备、检测和结果判定方法。本标准适用于相关贸易和有害生物监测中地中海实蝇卵、幼虫、蝠的鉴定和成虫的鉴定或复核。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(
4、包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 2039 地中海实蝇检疫鉴定方法PCR法3 缩略语SN/T 2039界定的缩略语适用于本文件。4 方法原理选择实蝇科昆虫线粒体DNACOI基因核昔酸片段为分子标记探针，将探针按预先设置的排列固定于特定的固相支持载体(如:醒基化基片)的表面形成微点阵，利用反向固相杂交技术，用Cy3标记脱氧胞昔三磷酸CCy3-dCTP)荧光标记的样品分子与微点阵上的探针杂交，实现多个分子之间的杂交反应，并通过芯片扫描信号的判读来检测样品中特定基因片段的存在，最后确定是否为地中海实蝇。5 仪器和用具PCR扩增仪、芯片点样仪、芯片扫描仪、离心机、水浴锅、涡旋器、冰箱、电子天平
5、、烘箱、磁力搅拌器。醒基化基片、多孔板、芯片盖片、芯片分隔围栏、芯片粘贴工具、湿盒、杂交盒、计时器、磁柱、芯片架、2L烧杯、15mL离心管、量筒、移液器等。6 试剂6.1 昆虫基因组DNA提取试剂盒。6.2 DNA快速纯化/回收试剂盒。6.3 去离子水。6.4 50%二甲基亚枫CDMSO)。6.5 0.2%十二皖基磺酸铀CSDS)。6.6 0.2%棚氢化纳。G/T 28065-2011 6.7 10XSSPE (20XSSPE:3 mol/L氯化铀，200mmol/L磷酸二氢铀，25mmol/L EDTA, pH 7.的。6.8 0.3XSSC、0.06XSSC(20XSSC:3 mol/L氧
6、化铀，300mmol/L拧棱酸铀)。6.9 10XPCR缓冲液(Mg2+,15 mmol/L)。6.10 dATP, dTTP, dCTP , dGTP (10 pmol/L)。6. 11 Cy3-dCTP。6.12 Taq酶。6.13 引物(10pmol/L)。6.14 探针(50mol/L)。6. 15 阳性质粒。6. 16 乙酶(70%和99.9%)。6.17 洗液1(0. 3XSSC,0. 2% SDS)。6. 18 洗液1I(0.06 X SSC)。7 生物芯片检测方法7. 1 样品前处理按照SNjT2039进行。7.2 基因组DNA制备按照SNjT2039进行。7.3 生物芯片探针
7、7.3.1 检测探针检测探针包括以下类型的探针(见A.1): 一一实蝇科通用探针;地中海实蝇与纳塔尔实蝇近缘种特异探针;一-地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种特异探针;一地中海实蝇种特异探针;一一纳塔尔实蝇c.rosa种特异探针;一非洲芒果实蝇C.cosyra种特异探针。注1:检测探针是一条20nt29 nt的寡核营酸z序列为实蝇科昆虫的特异性序列，5端氨基修饰。注2:实蝇科通用探针能够特异检测实蝇科昆虫，近缘种探针能够特异检测相应的两个近缘种，地中海实蝇、纳塔尔实蝇和非洲芒果实蝇种特异性探针分别可特异检测上述三种实蝇。7.3.2 质控探针质控探针包括以下四种类型探针(见A.2): 定位点探针;一
8、一阳性对照探针;阴性对照探针;一一空白对照。7.4 芯片制备7.4. 1 芯片基片:选择光学级醒基基片。 GB/T 28065-2011 7.4.2 探针稀释:探针用50%DMSO溶解至终浓度为50mol/L，按照探针点阵排布顺序，将探针溶液用移液器加入多孔板中。7.4.3 点样:用芯片点样仪将探针点至基片上。实蝇芯片探针阵列排布图参见B.1。一张基片四个探针点阵的示意图参见B.20 注:每个阵列共5行10列，第1行和第1列为定位点探针，其他探针各设三个重复。每张基片可以根据实际需求点1个或多个相同探针点阵。7.4.4 水合z基片置湿盒(内盛三分之一体积水)，在烘箱37oC水合12h。7.4.
9、5 固定:将基片放在芯片架上，置盛有0.2%SDS溶液的烧杯中磁力搅拌漂洗5mino取出再放入盛有去离子水的烧杯中磁力搅拌漂洗3次，每次2mino 注:漂洗时溶液应没过基片，洗涤时应在洗液中加入磁柱，打开磁力搅拌器搅拌;每漂洗一次，更换去离子水。7.4.6 封闭:将固定的基片放入盛有O.2%NaB凡封闭液的烧杯中先磁力搅拌漂洗5min，关闭磁力搅拌器，静置5min，再磁力搅拌漂洗5mill;最后用去离子水磁力搅拌漂洗3次，每次2mino 7.4.7 质检:基片置15mL离心管中，2000 r/min离心2min除去水分F用芯片扫锚仪对基片进行预扫描质检，质检合格后芯片避光冷藏保存。注:基片表面
10、无残余固定剂，探针阵列完整，定位点清晰的为合格的芯片。7.5 荧光标记PCR荧光标记PCR反应在常规PCR仪上进行，引物P3和PS序列见C.1，标记PCR反应体系见C.2。扩增条件:940C908;94 oC 308、55oC 308、72oC 308，30个循环;72C 5 min。待测样品模板DNA和实蝇阳性质粒平行进行荧光标记PCR，阳性质粒基因序列见C.3。注2阳性质粒是一段人工合成的DNA片段，其5端和3端核背酸序列分别为引物民和PS的互补链。7.6 杂交反应7.6. 1 杂交液预热10XSSPE芯片杂交液在水浴锅中预热至50oC。7.6.2 变性分别取杂交液10L和PCR产物10L
11、(实蝇模板扩增产物8L和阳性质粒扩增产物2L)到一个灭菌的50L离心管中，涡旋混匀，在PCR仪上95oC变性5mino 7.6.3 杂交盖上芯片盖片，取变性后的产物20L加入点样区，芯片用锡锚纸包装，置湿盒中在烘箱460C避光杂交3ho 7.6.4 清洗杂交后的芯片依次在42oC预热的洗液I、洗液E中磁力搅拌清洗2min, 7.6.5 离心芯片置15mL离心管中，2000 r/min离心2min除去水分。7.7 芯片扫描杂交后的芯片用芯片扫描仪在远红外光区532nm处进行扫描，PMT值设为800。通过扫描仪软件获得所有探针阵列的荧光数据。注:芯片扫描结果存入计算机，扫描后芯片避光室温保存。3
12、GB/T 28065-2011 7.8 结果判读芯片杂交信号判读原则见附录D。在质控探针和定位点探针杂交信号正常的情况下，检测探针杂交信号满足以下情况判定为地中海实蝇:4 实蝇科探针(teph)杂交信号阳性;地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种探针(caro)杂交信号阳性;地中海实蝇和纳塔尔实蝇近缘种探针(caco)杂交信号阳性;一一地中海实蝇特异探针(ccca)杂交信号阳性。GB/T 28065-2011 附录A(规范性附录)地中海实蝇生物芯片检测探针、质控探针及探针阵到A.1 地中海实蝇生物芯片检测探针见表A.l。表A.1地中海实蝇生物芯片检测探针探针类型探针名称探针序列(5-3)特异性说明科通
13、用探针teph AGCAAAGACTGCTCCTATTGATAAT 实蝇科通用探针近缘种特异探针ATAGCTGGGGAATAATTTAATTG 地中海实蝇和非洲芒果实蝇caco 近缘种探针近缘种特异探针CGTTAAACCTCCAACTGTAAA 地中海实蝇和纳塔尔实蝇caro 近缘种探针种特异探针ccca AGAACAACGCCCGTTAAACC 地中海实蝇特异探针种特异探针ccco CTGTTAAACCCCCAACTGTGA 非洲芒果实蝇特异探针种特异探针cpro ACATAATGGAAGTGTGCTACAAC 纳塔尔实蝇特异探针A.2 地中海实蝇生物芯片检测质控探针见表A.20表A.2地中
14、海实蝇生物芯片检测质控探针类型代码序列(5-3)长度nt 定位点探针A TGGATACCCAACTTAGCTATTAATAGTC 28 阳性对照探针P TGAGACCAACCAACTGAAACG 21 阴性对照探针N GACTATAGTATAAGCGCGGTCCA 23 空白对照aB a空白对照为水对照。5 GB/T 28065-2011 附录B(资料性附录)芯片检测探针点阵图及在基片上布局示意图B.1 地中海实蝇芯片检测探针阵列示意图见图B.l。A A A A A A A A A teph teph teph A caco caco caco caro caro caro A ccca cc
15、ca ccca ccco ccco ccco cpro A P P P N N N B 图B.1地中海实蝇芯片检测探针阵列示意图B.2 探针点阵在基片上布局示意图见图B.2。说明2每张基片有四个探针点阵(小正方形区域)。图B.2探针点阵在基片上布局示意图6 A A cpro cpro B B 单位为毫米附录C(规范性附录)荧光标记PCR引物、反应体系和阳性质粒序列C.l 地中海实蝇生物芯片检测荧光标记PCR引物(李文芬等2008)见表C.L表C.l地中海实蝇生物芯片检测荧光标记PCR引物GB/T 28065-20门引物名称引物序列(5人3)长度正/反向来源基因nt P3 TTTTAGTTGAC
16、TGGCTACATTACATGG 27 正向COI P5 CTGGAGGGGTATTTTGAAGTCATT 24 反向C.2 荧光标记PCR反应体系见表C.2o表C.2荧光标记PCR反应体系见表试剂名称PCR反应体系终浓度杂交信号阳性参考体系a10X缓冲液(Mg2+) 1. 5 mmol/L 1.0L dNTpb 0.2 mmol/L 0.2L 正向引物P30.2 mmol/L 0.2L 反向引物P50.2 mmol/L 0.2L Tq酶1 U O. 15L DNA摸板或阳性质粒10 ng20 ng 0.5L 去离子水补足反应总体积到10L7.75L a反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体
17、积进行适当调整。b dNTP配川叫川TP1L， dCTP 1 p.L, dGTP 1L， dTTP O. 65 p.L叩Y35L，去离子水2.85L.C.3 实蝇芯片阳性质粒序列(扩增长度:235bp) TTTTAGTTGACTGGCTACATTACATGGCACGAGGAGTCTGCTACCCGAGAAACCATAT TCAGAGCGAATCATCTGTGAGCCGTTTCAGTTGGTTGGTCTCAAAAGCCCTTCCTGCCCAG AGTGATCTCACTCGTCGAGGCCATCGGCTCTGACGCGATATACGGTTGTGCCGAGTGTCAA TAGTTTCAAATGAGG
18、TAGCAGACTCCTCGTGAATGACTTCAAAATACCCCTCCAG 注:实蝇芯片阳性质粒载体为T载体。=oN|ONH阁。GB/T 28065-20门附录D(规范性附录)杂交信号阳性结果判读原则D.l 每个检测点信号值=该点荧光强度值一该点背景强度值。D.2 空白对照平均信号值=3个空白对照点信号值的平均值。D.3 阴性对照平均信号值=3个阴性对照点信号值的平均值一空白对照平均信号值。D.4 每条探针的每个检测点信号值空白对照平均信号值3倍阴性对照平均信号值即判读该检测点为阳性。D.5 每条探针的3个重复检测点平均值为阳性即判读该条探针杂交结果为阳性。D.6 如定位探针部分或全部为阴性，则表明探针与片基结合有问题，实验结果不准确，重做试验。D.7 如阳性对照为阴性，则表明扩增标记环节或杂交环节存在问题，实验结果不准确，重做试验。侵权必究qa-dfu n吕-EJFh-A去-nu4-0 1i-e口祷创一nu Fh-f飞-咱A-号一价书一定版权专有GB/T 28065-2011 打印H期:2012年4月19HF002A
