1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民11: ./、gB 和国国家标准GB/T 28070-2011 黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法Detection and identification of Tilletia walkeri Castlebury&Carris 2011-12-30发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-06-01实施发布GB/T 28070-20门剧吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局，深
2、圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:章桂明、程颖慧、王颖、陆清、凌杏元、龙海、陈枝楠、刘新娇、仲建忠、杨伟东、缪建键。I GB/T 28070-2011 黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了黑麦草腥黑粉菌的检疫鉴定方法和检疫鉴定流程，明确了取样和样品保存方法。本标准适用于黑麦草传带黑麦草腥黑粉菌的检测以及小麦中污染的黑麦草腥黑粉菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18085
3、植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 黑麦草腥黑粉菌基本信息中文名:黑麦草腥黑粉菌。学名:Tilletia walkeri Castlebury &. CarrisC简称TW)。英文名:ryegrass bunt。属真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、黑粉菌纲Ustomycetes、黑粉菌目Ustilaginales、腥黑粉菌科Tilletiaceae、腥黑粉菌属Tilletiac 病粒及附着于健康种子表面的冬抱子是病原菌进行远距离传播的主要途径，由于该病局部侵染的特性，
4、在收获期间很难有效的清除渥杂于健康种子中的病粒，因而病粒可随同小麦或黑麦草的资源性引种或科研性引种而进行远距离传播。黑麦草腥黑粉菌的其他信息参见附录A。4 方法原理根据操麦草腥黑粉菌的生物学和形态学特征以及分子生物学特征，应用相关仪器，包括显微镜和PCR仪等对小麦印度腥黑穗病菌进行鉴定。5 检疫鉴定流程检疫鉴定流程见图L1 GB/T 28070-2011 | 判定为不带TW抱子|镜检序列测定与比对实时荧光24-A检测常规月z检测菌瘦或洗涤检疫抱子平均值小于25m或大于35m判定为非TW黑麦草腥黑盼病菌检瘟鉴定流程图图1取样方法散装船运黑麦草种子及小麦参照GBjT18085取样方法进行取样。袋装
5、黑麦草及小麦参照SNjT2122取样方法进行取样。6 2 7 主要仪器设备和试剂7. 1 主要仪器设备7. 1. 1 摇床。7. 1. 2 显微镜。7. 1. 3 纯水器。7.1.4 测序仪。7. 1.5 电泳仪。7. 1. 6 低温冰箱。7. 1. 7 显微操作仪。7.1.8 超净工作台。7. 1. 9 高压灭菌锅。7. 1. 10 光照培养箱。7. 1. 11 旋涡振荡器。7. 1. 12 普通离心机。7. 1. 13 冷冻干燥机。7. 1. 14 凝肢成像仪。7. 1. 15 核酸蛋白分析仪。7. 1. 16 PCR仪(常规PCR仪、实时荧光PCR仪)。7. 1. 17 破壁针(具有平截
6、切面的针，能将于包子压碎)。7. 1. 18 培养皿(9cm)。7.1.19筛网(40m、20m)。7.1.20 孔径100m的毛细管。7. 1. 21 锥形瓶(250mL、500mL)。7. 1. 22 盖玻片(18mm X 18 mm)。7. 1. 23 PCR反应管(0.2mL,O. 5 mL)。7. 1.24 载玻片(25mmX76 mm)，厚(0.8 mml. 0 mm)。7.1.25 Tip头(0.1L10L，5L200L，100Ll000L)。7. 1. 26 可调微量移液器(2L，10L，20L，100L，200L，1000L)7.2 主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或
7、生化试剂。7.2. 1 三氯甲烧。7.2.2 异戊醇。7.2.3 异丙醇。7.2.4 醋酸铀。7.2.5 甲酷肢。7.2.6 70%乙醇。7.2.7 元水乙醇。7.2.8 Tris饱和酷。7.2.9 Taq酶。G/T 28070-20门3 GB/T 28070-20门7.2. 10 Gelatino 7.2. 11 澳化乙链。7.2. 12 DNA Marker。7.2. 13 PDA培养基。7.2. 14 SDS提取液。7.2. 15 PCR缓冲液。7.2. 16 电泳缓冲液。7.2. 17 上样缓冲液。7.2. 18 Bigdye试剂盒。7.2. 19 TaqMan Universal P
8、CR Master Mixo 7.2.20 席尔氏浮载剂，见GB/T18085 0 7.2.21 dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。8 检测与鉴定8. 1 实验室器皿和晒网前处理将所有实验器皿和筛网浸抱于1.6%的次氯酸锅中15min，然后用蒸馆水冲洗5次。8.2 形态学鉴定对查找到菌瘦，或通过洗涤检验获得冬抱子的，先进行形态学鉴定。对菌瘦采用解剖针挑取菌瘦的冬抱子，置于席尔氏液中制片，对洗涤检验采用滴管吸取冬于包子悬浮液制片，待冬抱子胶质黯允分展开后，进行封片，观察冬抱子的形状，抱壁结构，在100X油镜下测量冬抱子的大小，每个样品测量100个冬抱子。形态学鉴定的具体操作过
9、程且附录B，TW与近似种的形态学图参见附录ca8.3 单个冬强子直接分子检测对未查找到菌瘦，但通过洗涤检验发现疑似黑麦草腥黑粉菌冬抱子的，要进行单个抱子分子方法检测。每个PCR反应检测1个冬抱子，共检测5个冬抱子。每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。单个冬抱子直接分子鉴定的具体操作过程见附录Do8.4 抱子培养物的分子检测对未查找到菌瘦，但通过洗涤检验发现疑似黑麦草腥黑粉菌，而这些疑似黑麦草腥黑粉菌通过形态学和单个抱子检测无法获得准确结果时，则要对抱子进行培养(培养方法见E.1)，用培养物分子检测。每次PCR检测须设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。抱子培养物分子检测的
10、具体操作过程见附录E、附录F。8.5 序列测定与比对将PCR产物纯化后，进行测序，或由生物公司完成。把测序所得的核昔酸序列与己知的黑麦草腥黑粉菌相应序列进行比对。序列比对的具体操作过程见附录G。4 GB/T 28070-2011 9 结果判断与表述9. 1 形态学鉴定结果判断和表述对查找到的菌瘦中的冬抱子或通过洗涤检验获取的冬抱子，所观察的症状和形态学特征与黑麦草腥黑粉菌冬于包子的一致，且对其100个抱子大小测量平均值介于30m31m，则判定该样品中含有黑麦草腥黑粉菌;对其100个抱子大小测量平均值小于25m或者大于35m，则判定该样品不含有黑麦草腥黑粉菌;如抱子大小介于25m30m或31m3
11、5m之间，则判定该样品含有疑似黑麦草腥黑粉菌，须进行进一步分子检测。9.2 单个强子直接分子检测结果判断和表述9.2. 1 常规PCR检测结果判断和表述单个抱子进行常规PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如样品的扩增产生473bp的特异性条带，且测序比对与黑麦草腥黑粉菌一致的判定为该样品含有黑麦草腥黑粉菌，如没有PCR扩增条带的则须挑取抱子进行萌发，进行分子检测。9.2.2 实时荧光PCR检测结果判断和表述对单个抱子进行MGB探针实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则:一一检测Ct值小于或等于36，判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性;一
12、一检测Ct值大于36，应重做实时荧光PCR，再次扩增后，如Ct值小于或等于36，判定同上才日再次扩增后Ct值大于36，则需要挑取冬抱子进行萌发，用抱子培养物进行分子检测。9.3 抱子培养物分子检测结果判断和表述9.3.1 常规PCR判断和表述对抱子培养物进行常规PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如样品的扩增产生414bp(引物Tin11/Tin4)或473bp(引物P14)的特异性条带，则初步判定黑麦草腥黑穗菌检测结果呈阳性，但需进一步进行实时荧光PCR检测或序列测定与比对进行结果验证，按照实时荧光PCR检测或序列测定与比对结果进行最后结果判定;如该样品元特异性扩增
13、条带，则判定黑麦草腥黑穗菌检测结果呈阴性。9.3.2 实时荧光PCR结果判定和表述9.3.2.1 普通探针实时荧光PCR结果判定和表述普通探针的实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则:检测Ct值小于34，判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性;检测Ct值大于或等于34，判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性。9.3.2.2 MGB探针实时荧光PCR结果判断和表述MGB探针实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则:一一检测Ct值小于或等于36，判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性;一一检测Ct值大于或等于40，判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性;5
14、 GB/T 28070-2011 检测Ct值在3640之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后，如Ct值小于或等于36或者Ct值大于或等于40，判定同上。9.4 序到测定和比对把测序所得到的核昔酸序列与己知的黑麦草腥黑粉菌序列进行比对，如果与己知的黑麦草腥黑粉菌相应序列完全一致则判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性，不一致则判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性。10 样品与原始数据保存10. 1 样品保存存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月。如发现黑麦草腥黑粉菌，该样品应保存I年，以备复验，如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理。10.2 原始数据保存样品检
15、测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归挡，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。6 G/T 28070-20门附录A(资料性附录)黑麦草腥黑粉菌其他信息A.l 分布主要分布在美国、澳大利亚、新西兰、加拿大、丹麦、荷兰、日本、西班牙等国家。A.2 形态特征及寄主黑麦草腥黑粉菌局部为害黑麦草穗部，感病小穗形成深褐色菌瘦，外表由菌丝化的果皮包被，与感病子粒果皮本身具有的淡紫色难于区别，发病严重时，小穗的子房完全被黑粉菌抱子所代替。黑麦草腥黑粉菌冬子包子直径为25m35m(平均30m)，较T.indica的直径25m43m(35m)略小，冬抱子为淡黄褐色，或金褐色至暗褐色，外抱壁表面纹饰为粗糙的疵状突起
16、，呈同心轮纹状排列，疵突外观较T.indica更为粗糙。目前已知自然寄主仅为黑麦草。7 GB/T 28070-2011 B.1 菌瘦查找附录B(规范性附录)形态学鉴定在体视显微镜下，检查黑麦草种子中有元菌瘦。对于感病较重的种子，菌瘦颜色多呈暗紫褐色，不同于健康种子，感病种子因腥黑粉菌抱子而散发出三甲胶气味。对于感病轻微的种子，可采用将黑麦草种子浸泡在水中检查菌瘦。B.2 洗涤检验B. 2.1 取50g样品放入250mL锥形瓶中，加入100mL元菌蒸馆水(含0.01%Tween-20)，放于摇床200 r/min摇动3min以便释放抱子。B.2.2 将洗涤液倒在上层的40m的筛网上，20m筛网在
17、下层，进行抽气过滤，用500mL的锥形瓶接收滤液。B.2.3 用100mL元菌蒸馆水冲洗250mL锥形瓶中样品2次，然后将样品洗涤液倒在40m的筛网上，再用200mL300 mL元菌蒸馆水冲洗40m筛网，确保抱子从样品上分离。B.2.4 移去40m筛网，将20m筛网倾斜成450，用无菌蒸馆水将筛网上的抱子都冲洗下来，然后将抱子洗涤液倒入离心管中，1000 g离心3min。B.2.5 用移液管将上清缓缓吸出，最后加入席尔氏液，视沉淀物多少定容至100L500L，混匀，镜检。B.3 形态学鉴定用解剖针挑起少量抱子，置于席尔氏液中制片，在显微镜下观察抱子大小、颜色和抱壁结构，在100X油镜下测量10
18、0个冬抱子。B.4 结果判定形态学鉴定的结果判定见9.1。8 附录C(资料性附录)黑麦草腥黑粉病菌与近似种的于包子形态图C. 1 黑麦草腥黑粉病菌抱子显微形态图(EPPO，2004)见图C.L图C.1黑麦草腥黑粉病菌于自子显微形态圈C.2 黑麦草腥黑粉病菌抱子电镜扫描形态图OimPlaskowitz，2006)见图C.2。图C.2黑麦草腥黑粉病菌于包子电镜扫描形态圄C.3 小麦印度腥黑穗病菌抱子显微形态图(章桂明等，2005)见图C.3oGB/T 28070-2011 9 GB/T 28070-2011 可苦于民图C.3小麦印度腥黑穗病菌抱子显微形态图C.4 小麦印度腥黑穗病菌抱子电镜扫描形态
19、图(章桂明等，2005)见图C.40圄C.4小麦印度腥黑穗病菌西子电镜扫描形态图10 !,-G/T 28070-2011 附录D(规范性附录)单个冬抱子直接分子检测D.1 单个强子核酸制备菌瘦中冬抱子获取方法:用针刺破菌瘦，挑取其中不带植物组织的少许抱子，将这些抱子轻轻展布于载玻片上，在低倍镜下观察抱子是否分散开，再将单个抱子挑起，直接转移到PCR管的管盖中，在低倍镜下确认抱子是否已被成功放置。于包子悬浮液中冬抱子的获取方法:用显微操作系统(或在倒置显微镜下人工操作)从抱子悬浮液中吸取抱子，所用毛细管孔径为100rn，整个操作过程可在检测器上进行监控，也可在显微镜下直接进行观察，确认抱子己被吸
20、入毛细管内并被转移到PCR管的管盖内。用破壁针对放置在PCR管盖中的抱子实施破壁:在10X低倍镜下用破壁针头轻轻挤压抱子，促使抱子壁破裂，使抱子中的核酸释放出来，在显微镜下检测抱子壁是否已经被压破。快速将PCR反应混合液加到PCR管盖中，振荡?昆匀，置于冰上，振荡后离心。D.2 分子生物学检测D. 2.1 常规PCR检测D. 2. 1. 1 常规PCR引物序列常规PCR引物序列为:正向引物P14-1:5 -TGTTTGAGCCACGCT ATGACC-3 反向引物P14-2:5 -AACTTCCAAGGCGACCATTC-3 D. 2. 1. 2 常规PCR扩增体系及条件反应体系总体积为25L
21、，各成分终浓度为:2.5L10XPCR缓冲液Tris-HCl(pH8.0) 10 rnrnol/L , Mg2+ 1. 5 rnrnol/L , KCl 50 rnrnol/LJ , 2L dNTPs (2. 5 rnrnol!L) , O. 25L各引物(10rnol/L), O. 3L Taq酶(5U/fL L) , 2. 5L GelatinO. 01%Cwt/vol汀，无菌双蒸水17.2L。将反应体系混匀，离心后置于PCR仪中进行反应，每个PCR反应检测1个冬抱子，共检测5个冬抱子。用元菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作
22、为模板。PCR的反应条件为96.C预变性3rnin，然后进入循环反应:96.C变性15s , 59 .C退火15s，72.C延伸15s，共70次循环，72.C延伸10rnin. D. 2. 1. 3 琼脂糖凝股电泳每个样品取5L的PCR产物与1L的6X上样缓冲液渥合均匀，并加到含有澳化乙链(0.5g/rnL)的1.2%琼脂糖凝胶中，在120V下进行电泳。电泳结束后在凝胶成像系统中观察、拍照，并保存照片。GB/T 28070一20门D. 2. 2 实时荧光PCR检测D. 2. 2.1 实时荧光PCR引物及探针序列实时荧光PCR引物及探针序列为z正向引物MP3-1: 5 -CTCG AGCCACT
23、CCG TTGG-3 反向引物MP3-2:5人GACAACTCCAGTGATGGCTCC-3 探针序列MPb3:5人FAM-T ACTCTTCATTGCCCTCA-MGB-3 D.2.2.2 实时荧光PCR反应体系及条件反应体系总体积为5L，各成分为:实时荧光反应混合液2.5L TaqMan Universal PCR Master Mix，0.45L各引物(10mol!L)，0.1L探针(10mol/L)，无菌双蒸水1.5L。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个实时荧光PCR反应检测1个冬抱子，共检测5个冬抱子。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉病菌的
24、DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。设置扩增反应条件为50.C预热2min ,95 .C变性10min，然后进人循环反应:95.C变性15s , 60 .C 延伸1min，共40次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，以使该仪器能进行FAM荧光的检测。D.3 结果判定结果判定见9.2。12 GB/T 28070-20门附录E(规范性附录)于包子培养幅常规PCR检测E.l 袍子萌发挑取冬抱子，置于2%水琼脂培养基上，18C20 C、每日连续光照12h条件下培养10d，解剖镜下检查萌发情况。对萌发的抱子用接种针挑取置于PDA培养基上，20C 22 C培养20d。E. 2 抱子
25、培养物的核酸制备E. 2.1 称取0.1g培养物，放在无菌的多层滤纸上，吸去水分，置于元菌的研钵中，用液氮冷冻，用研磨棒将它们研成粉末。E. 2. 2 立即转移到2rnL的离心管中，加入65C预热的SDS提取液700L，置于水浴锅中65.C水浴30 rnin，期间不断提匀。E.2.3 加入5L10 rng/rnL RNA酶，充分混匀，在37C放置30rnin u E.2.4 加入等体积的Tris饱和醋，充分摇匀，在12000r/rnin下离心lSrnino E.2.5 取上清液，加人1! 1三氯甲烧/异戊醇(24: 1) ，在12000 r/rnin下离心15rnin;重复一次该步骤。E. 2
26、. 6 加入等体积预冷的异丙晖，轻轻摇晃，置于一20C冰箱静置30rnin，在12000 r/rnin下离心15 rnin。E. 2. 7 弃上清液，加入70%乙醇500L，12000 r/min 离心3m巾，弃上清液，重复2次。E. 2. 8 得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入30L50p. L TE或水，充分溶解后，测量DNA的纯度和浓度后置于一20C冰箱中保存。注:于包子培养物的核藏也可采用DNA提取试剂盒提取。E.3 DNA纯度与浓度的测定用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nrn处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算见式(E.1)和式(E.2):
27、 DNA纯度=ODZ60/0Dz80 .( E.1 ) DNA浓度印g/rnL)= 50 X ODZ60 . ( E.2 ) PCR级DNA溶液的ODZ60/ODZ80比值为1.71.9。E. 4 常规PCRE. 4.1 引物序列引物序列为:正向引物Tin11:5人TAA TGTTGGCGTGGCGGCA T -3 反向引物Tin4:5人CAACTCCAGTGATGGCTCCG-3 也可以选用D.2. 1. 1中的P14引物。13 GB/T 28070-2011 E. 4. 2 扩增体系及条件引物Tinll/Tin 4的反应体系总体积为25L，各成分为:2.5L 10 X PCR缓冲液Tris
28、-HCl(pH8. 0) 10 mmol/L , Mg2+ 1. 5 mmol/L , KCl 50 mmol/LJ , 1L dNTPs(10 mmol/L) ，0.1L各引物(25mol/L) ,0. 1L AmpliTaq(5 U/p.L) , 1L DNA(10 ng/ p.L) ，元菌双蒸水20.2Lo将反应体系混匀，离心后置于PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用元菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉菌的DNA作为模板，阴险对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。PCR的反应条件为940C预变性1min，然后进入循环反应:940C变性15s ,65 oC退火15s，720
29、C延伸15s，共25次循环，72oC延伸6min。引物P14的扩增体系和反应条件见D.2. 1. 2。E. 5 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳见D.2. 1. 3。E. 6 结果判定结果判定见9.3.1014 GB/T 28070-2011 附录F(规范性附录)于包子培养物实时荧光PCR检测F. 1 西子的萌发抱子的萌发见E.1。F.2 于包子培养物的核酸制备于包子培养物的核酸制备见E.2oF.3 DNA纯度与浓度的测定DNA纯度与浓度的测定见E.3oF.4 普通探针实时荧光PCR检测F. 4.1 引物及探针序到引物及探针序列为CFrederickR D ,2000): 引物序列同E.4.1。探
30、针序列为:5 -F AM-A TTCCCGGCTTCGGCG TCACT -T AMRA -3 F.4.2 反应体系及条件反应体系总体积为25L，各成分为:实时荧光反应混合液12.5L TaqMan Universal PCR Master Mix , 1L各引物(10mol/L)，lL探针(10mol/L)，lLDNAOO ng /L) ，元菌双蒸水8. 5L。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用元菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为50oC预热2min, 95 oC变性1
31、0min，然后进入循环反应:95 oc变性15s , 60 oc延伸1 min，共34次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，使该仪器能进行FAM荧光的检测。F.5 MGB探针实时荧光PCR检测F.5.1 引物及探针序到引物及探针序列为:正向引物MP2-1序列为:5 -AGCGCT AGG A TCA TGCGG-3 反向引物MP2-2序列为:5人CCCGGCTTCGGCGT-3 探针MPb2序列为:5-FAM-TCTGAGGCATCGCTG-MGB-315 G/T 28070-2011 也可采用D.2. 2.1中的引物和探针进行检测。F.5.2 反应体系及条件反应体系总体积为5L，各成分分
32、别为:实时荧光反应混合液2.5L TaqMan Universal PCR Master Mix, O. 45L各引物(10mol/L)，0.1L探针(10mol/L)，1L DNA(1 0 ng/ /-lL) ，元菌双蒸水O.5L。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为50.C预热2min, 95 .C变性10min，然后进入循环反应:95 .C变性15s , 60 .C延伸1 min，共40次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，使该
33、仪器能进行FAM荧光的检测。F.6 结果判定和表述结果判定和表述见9.3.2。16 G.l PCR扩增rDNA ITS片段PCR扩增方法如下:附录G(规范性附录)序列测定与比对ITS4引物序列:5 -TCCTCCGCTT A TTG A T A TGC-3 ITS5引物序列:5 -GGAAGT AAAAGTCGT AACAAGG-3 G.B/T 28070-2011 反应体系总体积为25L，各成分为:2. 5L 10 XPCR缓冲液Tris-HCl(pH8.0) 10 mmol/L , Mg2+ 1. 5 mmol/L , KCl 50 mmol/LJ , 2L dNTPs(2. 5 mmol
34、/L) , 1. 25L各引物(10mol/L), O. 3L Taq酶(5U/L)，lL DNA(lO ng/ fLL) ，无菌双蒸水16.7Lo反应条件为95oC预变性10min，然后进入循环反应:95 oC变性30s , 58 oC退火30s , 72 oc延伸1 min，共3臼5次循环，72oC延伸7min 电泳检测见D.2.1.3o。对符合条件的PCR产物进行纯化，直接测序，具体操作步骤见相关试剂盒说明书，也可将PCR产物送到生物公司进行测序。也可以用附录D、附录E中的常规PCR引物进行PCR扩增。G.2 序列比对把测序所得的核昔酸序列与已知的黑麦草腥黑粉菌的相对应的序列进行比对。G
35、.3 结果判定结果判定见9.4。17 FFON|ohoNH白。华人民共和国家标准黑麦草腥黑粉菌检症鉴定方法GB/T 28070-2011 国申峰中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X12301/16 印张1.5字数30千字2012年5月第一版2012年5月第一次印刷* 24.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价书号:155066. 1-44626 28070-2011 打印H期:2012年5月22H F002
