1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民主f二GB 和国国家标准GB/T 28071-2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of cucumber green mottle mosaic virus 2011-12-30发布数码防伪 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-06-01实施发布中华人民共和国国家标准黄瓜绿斑驳花叶病毒捡擅鉴定方法GB/T 28071-2011 晤中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(
2、010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤开本880X 1230 1/16 印张1字数21千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷* 书号:155066. 1-44627定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28071-2011 目U吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民
3、共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:陈青、陈红运、廖富荣、林石明、吴冰冰、冯黎霞、张永江。I GB/T 28071-2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子、苗木及其产品的检疫鉴定。2 黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息中文名:黄瓜绿斑驳花叶病毒。学名:cucumber green mottle mosac vrus 0 缩写:CGMMV。属烟草花叶病毒属Tobamovirus成员。CGMMV可通过接触传播，也可通过种子传播。蜻虫等常见瓜类病毒的传播介体不能传播CGMMVo
4、嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之一。植株一旦发病，如果未进行杀灭处理，土壤也可带毒，带毒土壤也可成为病害发生的侵染源。黄瓜绿斑驳花叶病毒的其他信息参见附录A。3 方法原理通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，并根据生物学特性进行检测鉴定。4 仪器设备、用具及试剂4. 1 仪器设备洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平(感量O.001 g)、超净工作台、旋涡混合仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅。4.2 用具微量移液器(0.5L，2
5、L，10L，20L，100L，200L，1000L)、化学PGR反应管和(或)96孔光化学PCR反应板、酶联板、研钵。4.3 试剂4.3. 1 酶联测定试剂(见附录B)。4.3.2 RT-PCR检测试剂(见附录。4.3.3 实时荧光RT-PCR检测试剂(见附录D)。4.3.4 生物学测定(参见附录E)。1 GB/T 28071-2011 5 样品制备5. 1 种子样晶制备及检瘟鉴定挑取500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，待长出3片4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不
6、成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。5.2 苗木检验鉴定有症状的苗木单独检测6没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同5.1。5.3 植物产品的检验鉴定植物产品有症状的部分(如:果实上的畸形、斑驳等)单独检测。没有症状或元法观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测。6 检测方法6. 1 双抗体夹心酶联免瘟吸附测定把制备的样品上清液加入已包被CGMMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片)应尽量与检
7、测样品致。具体操作见附录B。6.2 RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。6.3 实时荧光RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测。健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录D。6.4 生物学接种试验参见附录E。7 结果判定6. 1、6.2、6.3、6.4中如果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种子或苗木携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。一般是酶联测定为阳性后，RT-PC
8、R或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性即可判断为携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。必要时可进行生物接种试验。GB/T 28071-2011 8 样晶保存经检验确定携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4C，病株在一20C或者-80C冰箱中保存，做好标记和登记工作。9 结果记录与资料保存完整的实验记录包括:样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片。3 GB/T 28071-20门附录A(资料性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒简介A.1 寄主范围黄瓜绿斑驳花叶病毒在自然
9、界主要侵染西瓜(Citrulluslanatus)、甜瓜CCucumismelo)、黄瓜CCucumis sativus)、南瓜CCucurbitamoschata)、辄子C1 agenaria siceraria)、丝瓜CLuffacylindrica)、苦瓜CMomordicacharantia)等葫芦科植物。一些杂草也是CGMMV的寄主，主要包括北美克CAmaranthus blitoides)、反枝克CAmaranthusretroflexus)、天芥菜(HeliotroPium euro paeum)、马齿克CPortulacaoleracea)、龙葵(Solanumnigrum)等
10、。A.2 病害症状黄瓜:叶片斑驳并凸起，畸形，植株矮化，果实上可产生黄或银色条斑，果实严重受损。西瓜:受侵染叶片轻型叶斑驳，严重时出现痛斑，植株矮化，成熟期果实表面出现浓绿色圆斑，果肉变色和腐烂。甜瓜:茎端新叶出现黄斑，随叶片老化症状减轻。瓢子:叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化，叶脉呈操带状。A.3 分布地区CGMMV于1935年在英国首次发现和报道。目前在英国、希腊、罗马尼亚、匈牙利、印度、沙特阿拉伯、丹麦、德国、俄罗斯、保加利亚、捷克、巴西、爱尔兰、摩尔多瓦、瑞典、芬兰、韩国、朝鲜、以色列、波兰、日本、巴基斯坦和我国的大陆和台湾均有分布。A.4 血清学特性CGMMV具有很强的免疫原性。A
11、.5 粒体形态黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体为直杆状，长度为300nm，直径为18nm。A.6 基因组病毒基因组为正单链RNA，全长约6.4kb，编码4个蛋白;病毒基因组5和3端分别含有一段非编码区。4 GB/T 28071-2011 附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免疲吸附测定B.1 试剂B. 1. 1 包被抗体特异性的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体。B. 1.2 酶标抗体碱性磷酸醋酶标记的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体。B. 1.3 底物对硝基苯磷酸二铀(pNPP)。B. 1.4 PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4)NaCl 8.0 g NazHP04 1. 15 g KHzP04 0.2 g KCl 0.2
12、 g Tween-20 0.5 mL 加入900mL蒸锢水溶解，用NaOH或HCl调节pH值到7.4，蒸悟水定容至1L。每升PBS中加入0.5mL的Tween-20。B. 1.5 样晶抽提锺冲撞(pH7.4)PBST NaZS03 1 L 1. 3g PVP(MW24 00040 000) 20 g NaN3 0.2 g 用NaOH或HCl调节pH值到7.404 .C储存。B. 1.6 包被缓冲液(pH9.6)NaZC03 NaHC03 1. 59 g 2.93 g NaN3 0.2 g 加入900mL蒸锢水溶解，用HCl调节pH值到9.6，蒸馆定容至1Lo 4 oC储存。B. 1.7 酶标抗
13、体稀释缓冲渣(pH7.4)PBST BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉1 L 2.0 g 5 GB/T 28071-一2011PVP(MW24 00040 000) 20.0 g NaN3 0.2 g 用NaOH或HCl调节pH值到7.404 oC储存。B. 1.8 底物(pNPP)缓冲液(pH9.8)MgC12 NaN3 二乙醇股0.1 g 0.2 g 97 mL 溶于800mL蒸馆水中，用HCl调pH值至9.8，蒸馆水定容至1Lo 4 oC储存。B.2 程序B. 2.1 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100L/孔，加盖，室温避光孵育4h或4oC 冰箱孵育过夜，清空酶
14、联板孔中榕液，PBST洗涤4次6次。B.2.2 样晶制备待测样品按1: 10(质量:体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r/min，离心10min，上清液即为制备好的检测样品。样品提取缓冲液作空白对照，阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B. 2. 3 加样加入制备好的检测样品、空白对照、阴性对照、阳性对照，100L/孔，加盖，室温避光孵育2h或40C冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4次6次。B.2.4 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100L/孔，加盖，室温避光孵育2h，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4次6
15、次。B.2.5 加底物将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用)，按100L/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。B.2.6 读数用酶联检测仪在30min、1h和2h于405nm处读00值。B.3 结果判断B. 3.1 对照孔的00405值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即:缓冲液孔和阴性对照孔的00值2;孔的重复性基本一致oB.3.2 在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下z样品00405值/阴性对照00405值明显2，判为阳性。6 GB/T 28071-2011 样品OD405值/阴性对照OD405值在阔值附近，判为可疑样品，需重
16、新做一次，或用其他方法加以验证。样品OD405值/阴性对照OD405值明显2，判为阴性。若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断。7 GB/T 28071-2011 C.1 试剂C. 1. 1 RNA提取试剂附录C(规范性附录)RT-PCR检测TRlzol reagent、三氯甲:皖、异丙醇、75%乙醇。C. 1.2 反转录试剂M-MLV RT(200 U/L)、5XRT缓冲液、dNTPOOmmol/L)、RNaseInhibitor(40 U/L)。C.2 PCR试剂10XPCR缓冲液(含15mmol/L的Mg2+)、TaqDNA聚合酶(5U/rL)、dNTPt昆合液(各10 mmo
17、l/L). C.3 实验步骤C. 3.1 总RNA提取称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的1.5 mL离心管中，加入1mL的TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置3min;4 .C , 12 000 g离心10min，取上清液;加入200L三氯甲烧，上下颠倒氓匀，室温静止3min;4 .C , 12000 g离心10min，取上层水相;加等体积的异丙醇，颠倒混匀;4.C , 12000 g离心10min，弃上清;:tJo1 mL 75%的乙醇洗涤沉淀，4.C，7500g离心5min，弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后，溶于30L经DEPC(焦碳酸二乙醋)处理的ddH20，-
18、20.C保存备用。C. 3. 2 RT-PCR反应C. 3. 2.1 引物序列上游引物CGMMV1:5人CgTggTAAgCggCA TTCT AAACCTC-3 下游引物CGMMV2: 5 -CCgCAAACCAA T gAgCAAACCg-3 RT-PCR产物大小654bp。C. 3. 2. 2 cDNA合成反转录总体系为12.5L.在PCR管中依次加入3L总RNA，lLCGMMV2引物，在65.C温浴7min，然后，冰浴5min，瞬离，再向PCR管中加入下列试剂:M-MLVRT(200 U/rL)O. 5L、5XRT缓冲液2.5L、dNTP(10 mmol/L) O. 5L、RNasin
19、(40U/L) 0.5L、DEPC处理的ddH204.5L。反应参数:37.C60 min, 95 .C 10 min。合成的cDNA于一20.C冰箱保存备用。C. 3. 2. 3 PCR扩增PCR反应体系见表C.L反应参数:95.C4 min;95 .C 60 s , 60 .C 50 s , 72 .C 60 s，30个循环572 .C 10 min。也可采用一步法RT-PCR试剂盒进行扩增。GB/T 28071-20门表C.1PCR反应体系10XPCR缓冲液2.5 dNTPOO mmol/L) 1. 0 CGMMV1(20 pmo!/L) 0.5 CGMMV2(20 pmo!/L) 0.
20、5 Taq酶(5u;L) 0.2 cDNA模板3.0 ddH20 补足反应总体积至25LC. 3. 3 琼脂糖电泳C. 3. 3.1 制备凝胶配制1.0%(质量浓度)的琼脂糖凝肢。澳化乙镀可直接加入琼脂糖凝胶中(浓度为o.5g/mL) , 也可在电泳完成后用澳化乙链染色。C.3.3.2 电泳用1L6X加样缓冲液与5L样品混合，然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加入到琼脂糖凝胶孔中。接通电源，以3V / cm 5 V / cm电场强度进行电泳，约0.5h后观察结果。C.3.3.3 结果观察电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入装有O.5g/L的漠化乙链(EB)榕液的容器中染色，然后在清水中清洗后
21、，置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。C.4 结果判断阳性对照在654bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照元特异性扩增，样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照、阴性对照和空白对照正确，样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为阴性。9 G/T 28071-2011 附录D(规范性附录)实时荧光RT-PCR检测D. 1 主要试剂RNA提取试剂见C.1. 1, TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents。D.2 实时荧光RT-PCR检测D. 2.1 引物与探针引物和探针序列见表D.1，表D.1引物和探针序列及其在基因组中的位置名
22、称引物和探针序列位置CGMMV-F 5人gCATAgTgCTTTCCCgTTCAC-3 6 284 nt6 304 nt CGMMV-R 5 -T gCAgAA TT ACT gCCCA T AgAAAC-3 6 361 nt6 384 nt CGMMV-P CggTTT gCTCA TT ggTTTgCggA 6 315 nt6 337 nt D.2.2 RNA提取操作方法见C.3.1，D.2.3 反应体系实时荧光PCR反应体系见表D.2Q表D.2实时荧光RT-PCR反应体系试剂名称加样量L 2 X Master Mix without UNG 25.0 40 X MultiScribe a
23、nd RNase Inhibitor Mix 1. 25 CGGMV模板(RNA)3.0 CGMMV-F(20mol/L) 1. 0 CGMMV-R(20mol/L) 1. 0 CGMMV-P(20mol/L) 0.5 DEPC处理水补足反应总体积至50L10 D. 2. 4 实时荧光RT-PCR反应参数检测CGMMV反应参数见表D.3o表D.3实时荧光RT-PCR反应参数作用温度反转录48 c 活化DNA合成酶和预变性95 C PCR(40个循环)变性95 c 延伸60 C D.3 结果判定检测样品的Ct值大于或等于40时，则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阴性。检测样品的Ct值小于或等于35时，则判
24、定黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性。GB/T 28071-20门时间30 min 10 min 15 s 1 min 检测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值大于或等于40时，则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阴性;如果重新测试的Ct值小于40，则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性。二ONlFhoNH阁。GB/T 28071-2011 附录(资料性附录)生物学接种E 接种病叶加1: 3C质量2体积)的磷酸盐缓冲液(0.01mol/L , pH 7.2)于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。E. 1 寄主及症状E. 2 鉴别寄主黄瓜CCucumissativus):系统侵染;褪绿斑;花叶。西瓜(Citrulluslanatus) :系统花叶。E. 2.1 桔斑寄主克色寨(Chenopodiumamaranticolour):局部侵染;枯斑。曼陀罗(Daturastramonium) :局部侵染;枯斑。碧冬茄CPetuniahybrida) :局部侵染;枯斑。E. 2. 2 侵权必究n, qL pnu AUA哇-噜EA- nhu pnu nu -kiv 卢hJV唱EA-EI -号一价书一定晤版权专有18.00元打印日期:2012年5月22日F002
