1、ICS 65.020.01 B 16 道B和国国家标准11: ./、中华人民GB/T 28072-2011 梨黑斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Alternaria gaisen K. Nagano 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪/中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 28072-2011 目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国河北出入境检
2、验检疫局。本标准主要起草人:严进、宋福、赵文胜、吴品珊、王朝华、陈克、黄英、陈岩、张秋娥。I GB/T 28072-2011 梨黑斑病菌检疫鉴定方法1 范围本标准确立了梨黑斑病菌检疫检测和鉴定方法。本标准适用于对来自梨黑斑病发生国家和地区的梨果实和梨属繁殖材料的检疫，以及国内疑似梨黑斑病的果实、叶片和枝条的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 梨黑斑病菌基本信息梨黑斑链格抱(Alternariaga
3、isen K. Nagano)属真菌界Fungi，有丝分裂抱子真菌Mitosporicfungi。梨黑斑病菌其他信息参见附录A。4 方法原理对梨黑斑病菌的鉴定可根据该真菌的寄主范围、传播途径、造成的植株症状(参见附录B)、病原形态(参见附录C和附录D)以及是否对梨叶片致病等进行鉴定。5 主要仪器设备5. 1 仪器设备体视显微镜、生物显微镜(具油镜和测微尺)、普通天平(感量0.1g)、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌器。5.2 试验用具手持放大镜、培养皿、三角瓶(500mL)、试管(直径12mm)、烧杯(1000 mL)、手术刀、手术剪、慑子、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯。6 检瘟与鉴定6
4、. 1 现场检疫6. 1. 1 取样按照SN/T2122规定的方法执行。GB/T 28072-2011 田间取样方法:在果实生长期，仔细检查果园中果树，采集有典型梨黑斑病症状的果实、叶片和嫩梢。6.1.2 症状观察6. 1. 2. 1 果实症状幼果发病初期，果面出现黑色小斑点，逐渐扩大呈圆形，病斑稍凹陷;成熟果实受害时，初期症状与幼果相似，但发病快，病斑大，不规则，黑褐色。数个病斑可融合成大块病斑，果面变黑褐色。6. 1. 2. 2 叶片症状嫩叶容易受害。叶片病斑初期为圆形或不规则形，后扩大呈同心环纹状，暗褐色，有时数个病斑融合成不规则形大块病斑，并出现淡紫色环纹。湿度高时，病斑上产生黑色霉层
5、。6. 1. 2. 3 新梢症状产生黑色小斑点，发展成长椭圆形，暗褐色，凹陷，病健交接处产生裂缝。湿度高时，病斑表面有霉状物。6.2 实验室检测与鉴定6.2. 1 分离培养采用马铃薯-胡萝卡培养基(PCA)(马铃薯20g、胡萝卡20g、琼脂15g、蒸馆水1000mL)，用于病原菌的分离、鉴定和菌种保存。果实:在病斑周围的病健交界处用70%酒精擦洗消毒，用解剖刀去除表皮，取少许果肉腐烂部分放在PCA培养基上，置于25.C培养箱中，12h光照，12h黑暗条件下培养3d5 d o 叶片和新梢:取病健交界部位边长约0.5cm组织，用0.5%NaCIO表面消毒3min，用元菌水冲洗3遍，置于PCA平板(
6、直径9cm)培养基上，每皿放置3片4片，于25.C培养箱内培养，黑暗和光照各12 h交替。3d5 d后用显微镜检查。6.2.2 形态鉴定6.2.2. 1 产抱表型观察将出现链格抱菌的培养皿置于实体显微镜，在50X下观察，用极细解剖针(00号)挑取具有典型A. gaisen产抱结构的单根抱子链上的抱子转接于PCA培养基平板上。将该培养基平板置于20.C 25.C的平台上，两支40W冷白光(4200k)灯管，8h照射和16h黑暗交替进行培养，灯管距离培养物约40 cm，培养物面向上，培养7d后将培养皿置于实体显微镜下(培养物面向上)观察产抱表型。6.2.2.2 分生强子形态测量从菌落中挑取少量培养
7、物，以水作浮载剂，制成玻片，在显微镜下观察。详细记录并测量分生抱子大小，包括长、宽、朦长、横隔膜数、纵(斜)隔膜数，抱子颜色，抱子表面有无突起等。每个菌株测量30个抱子。6.2.3 致病性测定将已初步鉴定的菌株进行叶片接种试验，取沙梨(Pyrus户yr价lia)的嫩叶，每个菌株接种5片叶，在叶片的正反两面用针刺造成伤口，将配好的抱子悬浮液(600000个抱子/mL)均匀涂在叶片的正反两GB/T 28072-2011 面，以元菌水为对照。将接种的叶片置于25.C士O.5.C的条件下培养5d，期间12h光照和12h黑暗交替，观察并记录发病情况。7 结果判定7. 1 产抱表型分生抱子链直立，不分枝或
8、基本不分枝，多数抱子链含5个9个抱子。7.2 分生于包子形态分生抱子短卵形或长卵形，抱身(12.2m35.0户m)X (5.8m14. 5m)，平均21.6mX 10.3m，朦呈短柱状或锥状，(2. 0m8. 7m) X (2.3m4.6m)，平均4.1mX3.7m，抱子的横隔膜数为14，纵斜隔膜数为O3oAlternaria gaisen与近似种形态参见附录C和附录D。7.3 致病性测定叶片病斑初期为圆形或不规则形，后扩大成同心环纹状，暗褐色，有时数个病斑融合成不规则形大块病斑，并出现淡紫色环纹。湿度高时，病斑上产生黑色霉层。7.4 结论如鉴定结果与7.1、7.2、7.3相符合，即可确定分离
9、物为梨黑斑链格抱Alternariagaisen K. Naganoo 8 样品保存将分离后纯化获得的梨黑斑链格抱Alternariagaisen菌种转入PCA斜面，置于常温条件下保存至少12个月，以各复验、谈判和仲裁。3 GB/T 28072-2011 附录A(资料性附录)梨黑斑病菌Alternariagaisen分布和寄主A.1 分布欧洲z法国、意大利。亚洲:中国(辽宁、吉林、青海、新疆、山东、河北、江苏、浙江、河南、广东、广西、山西、台湾)、日本、韩国。北美洲:美国(加里福尼亚、马里兰、密执安)。A.2 寄主梨黑斑链格抱的寄主只有梨属PyrusL.。4 卜一病果后期症状;2一一病果初期症
10、状;3一一病叶及病部放大。附录B(资料性附录)梨黑斑病症状GB/T 28072-2011 3 (图片来自华中农业大学植物科技学院农业植物病理学网络课件http:/uhjy.hzau. edu. cn) 图B.1梨黑斑病症状图B.2储藏期果实症状5 G/T 28072-2011 附录C(资料性附录)表C.1梨黑斑病菌Alternariagaisen与近似种区别学名产抱表型分生抱子形态对梨叶致病性分生抱子链直立，于包身02.2m-35.0m)X(9.8m-18.5m)，不分校或基本不分平均21.6mX 15.3m A. gaisen 校，多数抱子链含假嗦呈短柱状或锥状，(2.。m-8.7m)X对梨
11、叶致病5个-9个抱子(2.3m4.6m)，平均4.1mX3.7m横隔膜数为1-4，纵斜隔膜数为0-3抱身01.3m-31.0m)X(5.2m15. 0m)， 分生抱子链分枝平均21.5mX 10.3m A. alternata 假嗦呈短柱状或锥状，(1. 8m-7.9m)X 对梨叶不致病繁复，致密(2.3m4.5m)，平均4.0mX3.7m横隔膜数为1-4，纵斜隔膜数为0-3分生抱子较长，倒棍棒形、卵形或长椭圆形，于包身分生抱子链长，每(23.2m47. 1m) X (6. 6m-14.7m)，平均A. tenuissima 链10个-15(-20)29.3mX10.5m 对梨叶不致病个抱子，
12、分校很少假朦(4.1m-12.5m)X (2. 3m-4.7m)，平或元均6.7mX3.6m横隔膜数为1-6，纵斜隔膜数为0-4。分生抱子倒棍棒形、卵形、长或短椭圆形，抱身(14.4m51. 0m)X(5.6m-16.3m)，平均A. infectoria 分生抱子链分校27.7mX11.4m 对梨叶不致病松散，次生抱子梗长假嗦(6.1m-23.5m)X (2. 2m-4.7m)，平均10.2mX3.5m横隔膜数为2-7，纵斜隔膜数为0-56 GB/T 28072-2011 附录D(资料性附录)梨黑斑病菌Alternariagaisen和近似种形态示意图、警毒-A矗E需品咀嚼矗霄u#4串事童事
13、iHL图D.1梨黑斑链格抱Alternariagaisen 图D.2链格抱Alternariaalternata 旦、? t 在, F P矶，、-庐iF飞, 1 民拿喃当、图D.3细极链格抱Alternariatenuissima 图D.4僵染链格抱Alternariainf ectoria 注:以上图片由美国农业部农业研究所RodneyG. Roberts先生提供FFONlNhoNH阁。国华人民共和国家标准梨黑斑病菌检疫鉴定方法GB/T 28072-2011 中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销当&印张O.75 字数15千字2012年3月第一次印刷开本880X12301/16 2012年3月第一版导16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价书号:155066 1-44628 28072-2011 打印日期:2012年4月19HF002A G
