1、ICS 65.020.01 B 16 道B和国国家标准11: ./、中华人民GB/T 28075-2011 萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法Detection and identification of Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola CBurkholder) Gardan et al. 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法GB/T 28075-2011 导中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里
2、西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数22千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷峰15号:155066. 1-44631定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28075-2011 剧吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准使用重新起草法参考国际种子检验协会(ln
3、ternationalSeed Testing Associa tion, 1ST A)的Seed Health Testing Methods第7-023号标准豌豆中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测编制，与7-023 :2008标准的一致性程度为非等效。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人:林石明、陈青、黄蓬英、易建平、廖富荣、吴援、陈红运、王宏毅。I GB/T 28075-2011 范围萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法本标准规定了萨氏假单胞杆菌菜豆
4、生致病型的生物学、血清学和分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料及其产品中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测与鉴定。2 萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型基本信息中文名:萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型(菜豆晕疫病菌)。学名:Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (Burkholder, 1926) Gardan, Bollet, Abu Ghorrah, Grimont & Grimont, 19920 病害英文名:halo blight of bean 同物异名:Bacterium medicaginis var. phaseolicola
5、 (Burkholder) Link & H ull , 1927 Bacterium puerariae Hedges, 1927 Phytomonas medicaginis (Sackett) var.haseolicola Burkholder, 1926 Phytomonas puerariae (Hedges) Bergey et al. ,1930 Pseudomonas medicaginis var.haseolicola(Burkholder) Stapp & Kotte,1929 Pseudomonas medicaginis f. sp.haseolicola(Burk
6、holder) Dowson, 1957 Pseudomonas medicaginis Burkholder, 1926 Pseudomonas phaseolicola (Burkholder) Dowson, 1943 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola(Burkholder)Young,Dye & Wilkie,1978 Xanthomonas medicaginis var. phaseolicola(Burkholder) Elliot, 1951 属原核生物界Procaryotes、变形细菌门Proteobacteria、Y变形细菌纲Gam
7、maproteobacteria、假单胞杆菌目Pseudomonadales、假单胞杆菌科Pseudomonadace挝、假单胞杆菌属Pseudomonas。萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的其他信息参见附录A。3 方法原理依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、基于体外DNA合成技术的聚合酶链式反应(PCR)以及病菌接种后的致病特征等进行检测鉴定。4 主要试剂本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂:蛋白脏、氧化铀、硫酸镜、磷酸氢二饵、蔚糖、酷胶酸、甘油、棚酸、头抱氨节、万古霉素、澳酣蓝、放线(菌)酣或制霉菌素、三氯甲;皖、异
8、戊醇、异丙醇、Tris-盐酸、EDTA、SDS(十二烧基硫酸铀)、CTAB(十六皖基三甲基澳化胶)、漠化乙链等PCR相关试剂。1 GB/T 28075-2011 5 主要仪器本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备z超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定仪、酶标仪。6 病菌分离6. 1 种子样品的制备检查种子表面的为害状与异常情况，感病豆英的种子可能皱缩，种皮有奶黄色的斑块。每份检测样品至少检测2000粒种子。根据检测种子样品的质量(g)，按照1: 1. 5(质量=体积)的比例，在样品种子中加入元菌蒸馆水，如500g种子
9、则加入750mL;于40C50C下静置12h18h。取种子浸出液10 mL，用15550g离心5min，用蒸馆水分2次(每次1mL)洗下沉淀物，制成种子浸出液。6.2 种子中病菌的分离培养取100L的种子浸出被涂布于MT和(或)MSP培养基平板(培养基的配制见附录B)。每个处理至少3个5个重复，无菌水作为空白对照。在270C土20C下培养，3d后开始观察。发现可疑菌落(菌落形态特征见6.4)，将菌落转移至KB平板上培养1d2 d(培养基的配制见附录白，纯化3次后进行生化鉴定、或DA&-ELlSA、或PCR等方法鉴定。6.3 植物组织中病菌的分离培养仔细检查症状(参见图A.7)，用兀菌刀片将感染
10、组织切成细的切块，加一滴元菌水置于载玻片上，然后盖上盖玻片在显微镜下观察细菌的菌脏。如有，直接蘸取菌肢，或将菌服转移入1mL元菌水中，在MT和(或)MSP平板上划线分离(培养基的配制见附录B)。选择新鲜症状的叶片、豆英等组织，切取病斑前沿部分2mm7mm的组织，用70%酒精表面消毒15 s，无菌水洗2次3次，在MT和(或)MSP平板上培养。在270C士20C下培养.3d后开始观察。发现可疑菌落(菌落形态特征见6.的，将菌落转移至KB平板上培养1d2 d(培养基的配制见附录白，纯化3次后进行生化鉴定、或DA&-ELlSA、或PCR等方法鉴定。6.4 菌落形态特征可疑菌落在KB培养基上划区培养至少
11、20个菌落，在280C下培养24h48 h，观察有元荧光色素产生，并进行革兰氏染色及鞭毛染色。菌落在以下培养基上产生如下特征，可以确定可疑菌落。在MSP培养基上:Psph菌落圆形、隆起、球形、发亮、淡黄色、中央略浅。3d后，菌落边缘的培养基变成淡黄色(参见图A.6)。在MT培养基上:Psph菌落奶油状、乳白色、扁平、圆形、直径4.5 mm5. 0 mm;在紫外光下，多数菌落产生淡蓝色的荧光(参见图A.7)。在KB培养基上:Psph的菌落扁平、乳白色和奶油状;3d后，产生蓝绿色荧光。丁香假单胞杆菌丁香致病型CPseonomonassyri咆aepv. s)盯ngae)的一些菌株与Psph一样，在
12、MSP培养基上培养3d后，菌落边缘的培养基也变成1炎黄色。但是，Psph的菌落边缘不整齐。GB/T 28075-2011 7 病菌鉴定7. 1 生化鉴定采用BIOLOG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定。7.2 DAS-ELISA方法将可疑菌落配制成104CFU/mL悬浮液，取100L悬浮液作为检测样品。每个检测样品重复一次。用已知菌株作阳性对照，用缓冲液作空白对照。具体操作步骤见附录C。7.3 PCR方法将可疑菌落制备成108CFU/mL的细菌悬浮液，进行PCR扩增。或者把可疑菌落转到NB培养基中(培养基配制见附录B)，在250C士20C下振荡培养过夜，离心后提取沉淀的DNA，进行PCR扩增
13、。用已知菌株作阳性对照，用元菌水作空白对照。具体操作步骤见附录D。7.4 致病性测试7.4.1 概述如果生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性，则进行致病性测试以确认鉴定结果。致病性测定采用以下针刺接种法或浸泡接种法。7.4.2 针刺接种用牙签或解剖针蘸取在KB培养基上有蓝绿荧光的纯化菌落，在弯颈期的小苗上刺伤接种子叶的近胚轴面。用元菌水接种叶片作空白对照。最少接种10个菌落，每个可疑的菌落接种10株以上小苗，每株接种至少2个接种点。每次接种前，牙签或解剖针都要消毒。接种4d5 d后，子叶内部可以见到典型的油脂状斑点。如果8d10 d后没有出现症状，
14、则可判定为非致病菌。7.4.3 浸泡接种将感病品种的种子播种在苗床或吸水纸上，保湿，250C黑暗条件下培养2d。可疑菌落在KB上培养1d2 d后，用元菌水配制成108CFU/mL的悬浮液。用解剖针挑开已充分吸水种子的子叶和种皮，在悬浮液中浸泡10min15 mino每个可疑菌落接种10粒以上种子。设元菌水作空白对照。将浸泡后的种子种植在元菌的土壤中，20oC下高湿培养5 d7 d。种子萌发后，在子叶上出现油脂状的斑点，第一真叶也可能出现症状。如果8d10 d后没有出现症状，则可判定为非致病菌。8 结果判定与检测报告8. 1 结果判定8. 1. 1 未分离到可疑菌落如果经MT或MSP培养基分离培
15、养，7d后仍未产生可疑菌落，则未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生3 GB/T 28075-2011 致病型。8. 1. 2 分离到可疑菌落分离培养后的可疑菌落，应经生化鉴定、或DAS-ELISA或PCR方法检测，并通过致病性测试的确认:如果生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性，致病性测试也产生典型症状，则判定为阳性，检出萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型;一一如果生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR的结果为阴性，则判定为阴性，未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型;如果生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性，但致病性测试为阴性，则应重
16、新进行致病性测试。致病性重新测试后，如果仍然未产生典型症状，则判定为未检出萨氏假单胞杆菌莱豆生致病型。8.2 检测报告检测报告应包含所采用的检测方法所产生的数据，包括DAS-ELISA检测结果的吸光值数据报告、菌落形态特征照片，PCR检测的电泳图片或致病性测试结果的照片等。4 G/T 28075-2011 附录A(资料性附录)萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型相关资料A.1 检疫重要性属2007年公布并实施的中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录。A.2 地理分布非洲z埃及、马达加斯加、尼日利亚、南非等。美洲:阿根廷、巴巴多斯、百慕大、巴西、加拿大、哥伦比亚、多米尼加、古巴、格林纳达、牙买加、墨西哥
17、、波多黎各、圣文森特、美国、乌拉圭、委内瑞拉等。亚洲:缅甸、柬埔寨、菲律宾、韩国、日本、印度尼西亚、以色列、文莱、黎巴嫩、马来西亚、尼泊尔、斯里兰卡、印度等。欧洲z保加利亚、英国、芬兰、法国、德国、希腊、荷兰、匈牙利、意大利、摩洛哥、葡萄牙、罗马尼亚、土耳其、俄罗斯、西班牙、前南斯拉夫、瑞士等。大洋洲z澳大利亚、新西兰、西萨摩亚等。A.3 寄主植物菜豆CPhaseolus vulgaris)、大豆CClycine max)，多花菜豆CP. multiflorus)、碗豆CPisum sativum)、绿豆CVignaradiate)、虹豆CV.unguiculata)、扁豆CDolichosl
18、ablab)、赤豆CPhaseolusangus laris )、木豆CCajanuscajan)、野葛CPu旷arathubergiana)和桑橙CMaclurapomifera)等。A.4 传播途径病菌附着在种子表面，多在种皮的外表和里面，严重为害时才侵入子叶，但不会侵入胚乳。种子带菌率一般在1%10%之间，一般的商业用种子带菌率为1%以下。病菌可通过种子进行远距离传播。田间可通过风吹雨溅，洒水灌溉传播，但沟灌或哇灌不会传播。冬季在土壤或菜豆植株残体上不能存活，但在于野葛的溃癌病斑上能越冬。A.5 症状特征该病菌可通过气孔侵入，引起系统侵染，叶、茎、英和种子等部位均可发病。病菌产生毒素导致
19、黄色褪绿晕圈，毒素可以转移到元病斑的叶片上，产生类似病毒病的中脉褪绿、花叶和畸形等症状。潮湿时叶、茎和英等部位的病斑上常有黄色粉状物。晕疫病的症状随温度等变化而异，一般在16oc 20 oc时才会有晕圈产生。大雨和低温有助于晕疫病的发生和蔓延，而温暖气候有利于细菌性萎焉病的发生。在叶片上，初期在叶的两面产生水渍状小斑点，扩大后成不规则形，深褐色，边缘有黄色晕圈，干燥时似羊皮纸，半透明，质脆易破裂，最后全叶干枯，严重时似火烧状;病斑周围具黄色褪绿晕圈，后期的叶片坏死，畸形。5 GB/T 28075-2011 叶片症状见图A.l图A.30在茎秤上，病斑为水渍状，红褐色，稍凹陷，长条形，后开裂，有时
20、渗出细菌菌服，引起茎的环状剥皮或萎藉。在豆英上，病斑(见图A.4)通常表现为类似脂点的暗绿色斑点，凹陷，近圆形或不规则形F豆英中的种子皱缩(见图A.日，有浅褐色凹陷的小斑，种皮偶有奶黄色的斑块等症状。在种子上，严重感染的干燥种子会变色，纵向皱缩或具外缘整齐、稠密的黄色斑。在紫外灯(350 nm450 nm)下观察，产生白色荧光的表明被感染。多数种子没有明显症状。图A.1菜豆叶片上的早期症状图A.2菜豆叶片上的症状图A.3绿豆叶片上的后期症状图A.4豆英上的暗绿色斑点图A.5豆英皱缩症状6 GB/T 28075-2011 A.6 菌落培养特征该病菌在不同的培养基上产生不同的特征，在MSP培养基上
21、的菌落特征参见图A.6，在MT培养基上的菌落特征参见图A.7 0 注:图片引自ISTA(200的。图A.6在MSP培养基上的菌落图A.7在MT培弊基上的菌落7 GB/T 28075-2011 B.1 生理盐水附录B(规范性附录)培养基的配制将8.5g氧化铀溶解于1000mL蒸锢水中，121.C湿热灭菌15min;加入0.2mL吐温-20。B.2 NB培养基(NutrientBroth) 蛋白陈5.0g，牛肉浸音3.0g，蒸馆水1000mL, 121 .C湿热灭菌15min. B.3 KB培养基(改良KB培养基，King，etal. , 1954) 称取以下试剂:3号阮蛋白陈20.0g，磷酸氢二
22、饵(KzHP04) 1. 5 g，硫酸镜(MgS04 7HzO) 1. 5 g , 甘油15.0mL，琼脂15.0g，倒入1L的烧杯中，加1000mL的蒸馆水，搅拌溶解。在121.C下湿热灭菌15min;冷却至45.C 50 .C后，加入头抱氨韦(Cephalexin)50 mg(溶解于75%的酒精中，配制成25X 10-6浓度。把培养基缓慢地倒入培养皿内(每个直径9cm的培养皿20mL)，避免产生气泡。培养基在超净工作台凝固后直接使用，或者反扣过来装入塑料袋中，在4.C下保存。最长的保存时间是2周3周，否则抗生素会失效。B.4 MT培养基(牛奶土温琼脂培养基，Goszczynska& Ser
23、fontein, 1998) 称取所有的A原液(见表B.1)倒入适宜的容器内，加500mL蒸馆水;将脱脂奶粉倒入500mL水中溶解;准备10mL的吐温-80;将A、B、C原液分别在121.C下灭菌消毒15min;在元菌的条件下，将B、C原液(见表B.l)加入A溶液中;待冷却到45.C50.C时才加入抗生素(见表B.1);缓慢地倒入培养皿内(每个直径9cm的培养皿20mL)，避免产生气泡。表B.1MT培养基配方分比例原液成mL或g/L3号阮蛋白陈10.0 g 氯化钙0.25 g A 酶胶酸0.5 g 琼脂15.0 g 蒸馆水500 mL 脱脂奶粉10.0 g B 蒸馆水500 mL 8 GB/T
24、 28075-2011 表B.1 (续原液成分比例mL或g/LC 吐温80(10%)10.0 mL 放线(菌)酣(cycloheximide)或40XlO-6的制每菌素200 mg D 头抱氨韦(cephalexin) 80.0 mg 万古霉素(vancomycin) 10.0 mg 在超净工作台凝固后直接使用，或者反扣过来装人塑料袋中，在40C下保存。最长的保存时间是2周3周，否则抗生素会失效。B.5 MSP培养基(改良的黯糖蛋白陈琼脂培养基，Mohan& Schaad, 1987) 称取所有的A原液(见表B.2)倒入适宜的容器内，加1000mL蒸懵水将试剂溶解z在121oC下灭菌消毒15m
25、in;将培养基冷却到45oC50 oC时加入抗生素(见表B.2);缓慢地倒入培养皿内(每个直径9cm的培养皿20mL)，避免产生气泡。表B.2MSP培养基配方原液成分比例mL或g/L糖20.0 g 3号阮蛋白陈5.0 g A 磷酸氢二饵(凡HPO.)0.5 g 硫酸钱(MgSO，. 7Hz 0) 0.25 g 琼脂20.0 g 放线(茵)酣(cycloheximide)或40X10的tJIJ每菌素200 mg 头抱氨韦(cephalexin)3.2 mL B 万古霉素(vancomycin) 1. 0 mL 澳盼蓝(bromothymolblue)1. 0 mL 在超净工作台凝固后直接使用，或
26、者反扣过来装入塑料袋中，在40C下保存。最长的保存时间是2周3周，否则抗生素会失效。9 GB/T 28075-20门C. 1 检测样品制备附录C(规范性附录)DAS-ELISA方法以种子浸出液可作为检测样品(制备方法见6.1)。将可疑菌落的纯培养物可配制成104CFU/mL的菌体悬浮液作为检测样品。C.2 包被根据DAS-ELISA检测试剂盒说明，用碳酸铀缓冲液稀释抗体溶液(如1: 200)，在微孔板中每孔加入100L包被抗体溶液。在室温下孵育2h4h或4.C下包被过夜。C.3 捕获抗原倒去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗3次(可在洗板机上完成)。加入样品提取物，每孔100L，每个样品2个孔(
27、重复1次)。并设置阳性/阴性和空白对照。在室温下孵育2h或4.C下过夜。C.4 加入酶标抗体根据说明用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如1: 200)。倒去孔中的样品提取液，用PBST洗3次(可在洗板机上完成)。每孔加入100L酶标抗体溶液。在室温下孵育2h. C.5 加底物用二乙醇胶缓冲液(pH9.8)配制1mg/mL的对硝基苯磷酸醋的底物溶液。倒去酶标抗体溶液，用PBST洗3次(可在洗板机上完成)。每孔加入100L新鲜配制的底物溶液。室温下避光放置，直至阳性对照孔明显显色(约30min60 min)。在准备底物溶液的过程中，不要接触药剂或暴露在强光中，避免在阴性对照孔中出现背景颜色。C.
28、6 结果判定C. 6.1 对照孔的OD4Q5值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即:缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值2;同一样品的OD4Q5值应基本一致。C. 6. 2 在满足了C.6.1质量要求后，结果原则上可判断如下:一一样品OD4Q5值/阴性对照OD削值明显2，判为阳性;样品OD4Q5值/阴性对照OD4Q5值在阔值附近，判为可疑样品，需重做一次或用其他方法验证;样品OD削值/阴性对照OD405值明显2，判为阴性。C. 6. 3 若满足不了C.6.1质量要求，则不能进行结果判断。D.1 PCR模板的制备D. 1. 1 菌悬渡PCR模板的制备附录D(规范性附录)PC
29、R方法GB/T 28075-2011 取3L的108CFU/mL (OD600 =0.1)的菌体悬浮液，转入装有100L元菌双蒸水的1.5L离心管中，在990C水浴10min, 10 OOOg离心10min，冷却后，取上清液作为PCR反应模板。D. 1. 2 DNA的提取取1mL在NB培养基中振荡培养过夜的菌液，10000g离心2min，提取沉淀的DNA;或者取0.1g 的发病植物组织，研磨后，提取植物总DNAo具体提取步骤根据所采用的DNA提取试剂盒。D.2 引物用于检测Psph的特异性引物及其序列见表D.1，可由有关生物公司合成和纯化。表D.1用于PCR检测的引物及其序列引物名称寻|物序列
30、扩增片断大小HB14F 5 -CAACTCCGACACCAGCGACCGAGC-3 1 375 bp HBl4R 5 -CCGGTCTGCTCG ACA TCGTGCCAC-3 D.3 PCR反应体系50L反应体系中加入:10XPCR缓冲液(含MgC12)5.0L，10mmol/L的dNTP混合物1.0L，Taq DNA聚合酶(5U/flL)O. 5L，10mol/L的上下引物各2.0L，DNA模板3L，去离子水补足至50Lo D.4 反应条件在PCR仪上完成以下程序:950C预变性3min;然后940C变性1min、650C退火1min、72oC延伸2 min，共35个循环;最后在720C下
31、保持10min。D.5 电泳分析取5L扩增产物与1L的6X上样缓冲液混合均匀，在1XTBE缓冲液配制的1.5%琼脂糖凝胶中，50V电泳45min，用荧光染料或澳化乙链(EB)染色后在成像系统中观察，拍照并保存。工ON-RONH益。G/T 28075-2011 结果判定在阳性对照扩增出预期的1375 bp大小的条带，阴性对照和空白对照没有扩增到预期大小条带的条件下:D.6 一一如果检测样品扩增到与阳性对照大小相一致的条带，则PCR检测结果为阳性;一一一如果检测样品没有扩增到与阳性对照大小相一致的条带，则PCR检测结果为阴性。侵权必究晤书号:155066 1-44631 定价:18.00元版权专有GB/T 28075-2011 打印H期:2012年4月26H F002A
