1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民=IJ工.，.、不日量国国国家标准GB/T 28078-2011 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Xanthomonas oryzae pv.oryzaeCIshiyama) Swings et al.、Xanthomonasoryzae pv. oryzicolaCFang et al. )Swings et aI. 2011-12-30发布数码防伪/ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-06-01实施发布GB/T 28078-20门
2、目U吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人:朱金国、赵文军、唐连飞、朱水芳、莫瑾、彭梓、陈红运、钟文英。I 1 范围水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检疫鉴定方法GB/T 28078-2011 本标准规定了水稻种子和其他水稻材料的水稻白叶枯病菌Xa1创omonasoryzae pv.oryzae(Xoo) 和水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzae pv. oryzico
3、la (Xcola)的检疫鉴定以植物的形态学特征、生理生化特性、分子生物学和酶联免疫学技术作为依据，明确了田间观察、分离鉴定、样品保存的方法。本标准适用于水稻材料和相关环境中水稻白叶桔病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 15569-1995 农业植物调运检疫规程ISTA 国际种子检验规程3 方法原理根据水稻植株的形态学特征进行田间观察，并采用分离培养、分子生物学和酶联免疫学筛选、生理生化鉴定以及致病性测定对植株材料上的水
4、稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌进行判定。4 设备和材料4. 1 冷冻高速离心机:转速运15000 r/mino 4.2 PCR扩增仪。4.3 恒温培养箱:280C士1oC。4.4 显微镜z物镜头lOX100X。4.5 天平:精度0.001go 4.6 高压灭菌器。4. 7 均质器z转速4000 r/min8 000 r/min。4.8 可调移液器:0.2LlL，lL10L，10L100L，100Ll000Lo 4.9 器具:灭菌的慑子、剪刀、称量勺。4. 10 吸管:1mL、10mL。4. 11 灭菌平皿:直径90mm，玻璃或一次性塑料平皿。4. 12 三角瓶:100mL。5 培养基和试剂5
5、.1 SPA培养基:见A.1。GB/T 28078一20115.2 0.001%吐温20-磷酸盐缓冲液。5.3 革兰氏染色试剂:见A.2.5.4 鞭毛染色试剂:见A.3.5.5 明胶液化培养基:见A.4。5.6 氧化酶试剂:见A.5。5. 7 硝酸盐培养基:见A.6。5.8 过氧化氢酶试验试剂:见A.7. 5.9 石部牛乳试剂:见A.8.5.10 糖氧化和发酵测定培养基:见A.9。5. 11 碳源利用试验培养基z见A.10。5.12 水杨昔产酸试验培养基z见A.11。5. 13 2，3，5-二苯基氯化四氮瞠(TTC)。6 田间检验水稻在整个生育期的叶片均可受害，在苗期、分费期受害最重，通过田间
6、观察可直接对水稻受害情况进行判断，水稻细菌性条斑病菌和水稻自叶枯病菌田间症状及相关资料参见附录B和附录C。对田间检验有病害发生的植株，按以下操作进行抽样及实验室检验。7 抽样水稻种子抽样可参照ISTA(国际种子检验规程或者GB15569- 1995 6.1方法进行。8 样品处理8. 1 水稻种子大量种子样品通常需先用蒸锢水冲洗以除去残片和表面的污染杂菌，以避免杂菌太多产生干扰。清洗后称取10g或400粒种子，放入0.001%吐温-磷酸缓冲液中低温(5C15 .C)浸泡4h6 h，用均质器打碎，制备样品提取液。如果是检测少量的种子样品，取20粒种子加入10mL灭菌的磷酸缓冲液，用灭菌槌和研钵或是
7、搅拌器将种子完全压碎制成提取液。将样品提取液于22oC25 oc环境中放置4h6 h.旋涡混匀悬浮液5min，制备10X、100X和1000X三个稀释度的悬浮液，从原液及每个梯度稀释液中取0.3mL，分别放入到3个SPA的平皿中(每个平皿加入0.1mL)。用L-型玻璃棒将液体均匀涂布在SPA琼脂的表面。若提取液杂菌较多，可考虑增加稀释梯度和接种平板的数量以提高检出率。8.2 植物组织材料8.2. 1 无症状的组织可将10g左右样品直接放入90mL O. 001 %吐温-磷酸盐缓冲液中，均质1min制备成样品提取液。按8.1方法进行稀释与涂布。8.2.2 未显症的可疑组织用灭菌的剪刀剪成小块，将
8、其置人SPA分离平板中，滴入2滴3滴(约0.2mL)的生理盐水，放2 GB/T 28078-2011 置5min10 min，让细菌从这些组织中渗出，用灭菌的接种环蘸取渗出液，在SPA培养基上进行分离培养。8.2.3 受感染组织从叶片损伤部位的前端切下2mmX7 mm片段。将其放人70%的乙醇消毒中15s30 s，然后在试管中用灭菌蒸馆水清洗叶片2次3次，最后将其置于SPA分离平板上。如植物组织材料上出现菌服或菌癫，直接用接种工具取菌服或菌癫于SPA分离平板上涂布。9 分离接种后每天观察SPA平板的菌株生长状况。水稻白叶枯病菌(Xoo)生长速度较慢，一般要在72 h96 h才形成可见菌落。菌落
9、呈圆形、光滑、表面凸起、粘稠，由黄白色逐渐变成1炎黄色，在发射光下不透明。菌落在第3天或第4天时只有小圆点般大小，在第5天至第7天时直径有1mm2 mm。水稻细菌性条斑病菌(Xcola)菌株则在48h72 h后出现，生长速度比Xoo快，菌落圆形、光滑、凸起、粘质，先为白色成熟后变浅黄色。菌落在第3天直径达到1mm。培养24h后开始观察菌落生长情况，标记并排除48h之内平板中出现的亮黄色菌落。选择浅黄色且带液样的单个菌落接种于SPA培养基中，每个平皿挑取5个以上典型或疑似菌落进一步培养纯化，以进行进一步生化鉴定试验。对疑似菌落也可以采用PCR方法进行初筛，或者采用水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病
10、菌的ELISA试剂盒进行初步筛选(具体检测方法参照试剂盒说明手册)，阳性结果再继续通过生化鉴定做进一步证实。10 PCR筛选试验从分离培养的细菌菌株中提取DNA作为模板，进行PCR检测和电泳分析。用水稻白叶枯标准菌株或水稻细菌性条斑标准菌株基因组DNA作为阳性对照，用不含有水稻白叶枯菌株或水稻细菌性条斑菌株的植物组织材料或其他植物病原菌基因组DNA为阴性对照，用双蒸水作空白对照，进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖电泳分析。将分离得到的可疑菌落接种SPA斜面，培养48h72 h后用无菌水洗下斜面上生长的菌苔，制成菌悬液。使用制备好的菌悬液按照附录D进行分子生物学鉴定。若测试菌株的PCR产物与阳
11、性对照相对分子质量一致，继续进行生化鉴定试验。11 生化鉴定11. 1 初步鉴定挑取分离培养得到的符合特征的可疑菌落分别进行氧化酶试验，过氧化氢酶试验、草兰氏染色和鞭毛染色观察，黄单胞菌属菌为氧化酶阴性或延迟反应(15s16 s)，过氧化氢酶阳性，革兰氏染色阴性，单生极鞭杆菌。符合以上试验结果的菌落则初步鉴定为疑似黄单胞菌属(Xanthomonas)。11. 2 硝酸盐还原试验于28.C培养后的菌悬液中加入硝酸盐还原试剂，观察颜色反应，黄单胞菌不利用硝酸盐，为不变色的阴性反应。3 GB/T 28078-2011 11. 3 明胶液化挑取纯化后菌落穿刺接种营养明胶琼脂后，28.C士1.C培养7d
12、14 d.每天观察结果，不加摇动，静置冰箱中待其凝固后，再观察其是否被液化，如确被液化，即为试验阳性。11. 4 石莓牛乳反应将纯化后菌接种于石蒋牛乳培养基中，置28.C :I: 1 .C孵育3d、7d和14d，定时观察结果。水稻细菌性条斑病细菌能够陈化牛乳中的醋蛋白，使培养基上层液体变澄清，而水稻白叶枯病菌没有陈化作用。11. 5 葡萄糖氧化和发酵测定挑取纯化后菌落剌接种到底部，厌氧培养的需加1cm厚的灭菌凡士林油(石蜡油与凡士林等量提合)或3mL 3%的琼脂封管。每种细菌接种4管，2管封管，2管不封，另设置2管不加菌进行对照。28 .C士1.C培养5d，观察结果。葡萄糖氧化产酸只在开管的上
13、部产酸，指示剂的颜色由橄榄绿色转黄;发酵产酸则在开管和闭管中都可产生酸，如果同时还产生气体，则培养基内可以看到气泡。好氧性细菌，只在开管的上部生长;兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长;厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。黄单胞菌为严格好氧性，属于氧化型(0)。11. 6 阿拉伯糖发酵步骤同葡萄糖发酵步骤。阳性菌产酸，培养基变黄色，阴性细菌不利用阿拉伯糖，培养基不变色。11. 7 利用天每酷腰为唯一碳源和氨源试验挑取纯化培养后菌落接种天冬氨酸为唯一碳源和氮源的培养基，28.C土1.C培养3d、7d和14d 后，观察生长情况，有菌落生长者为阳性。11. 8 利用丙氨酸为唯一碳源试验挑
14、取纯化培养后菌落接种丙氨酸为唯一碳源和氮源的培养基，28.C士1.C培养3d, 7 d和14d后，观察生长情况，有菌落生长者为阳性。11. 9 水杨苦产酸试验挑取纯化后菌落接种至含有1%水杨昔的培养基上，28.C土1.C培养5d，观察培养基颜色变化情况。产酸培养基变为黄色，产碱则变为蓝色。11. 10 青霉素敏感试验挑取纯化后菌落接种至含有20g/mL青霉素的SPA蛋白陈培养基上，28.C培养3d5 d，观察菌落生长情况，有菌落生长者为阳性。11. 11 TTC生长试验挑取纯化后菌落接种至含有O.l%TTC的SPA培养基上，28.C士1.C培养3d5 d，观察菌落生长情况，有菌落生长者为阳性。
15、4 GB/T 28078-2011 11. 12 0.001% CU(N03)2生长试验挑取纯化后菌落接种至含有0.001%CU(N03)2的SPA培养基上，28.C土1.C培养3d5 d，观察菌落生长情况，有菌落生长者为阳性。11. 13 黄单胞菌主要生化特征及Xoo和Xcola主要生化差别见表1，表中部分结果相同的生化试验用以区分黄单胞菌属和假单胞菌属(参见附录E)。表1黄单胞菌主要生化特征及Xoo和Xcola主要生化差别生化反应白叶枯病细菌细菌性条斑病细菌氧化酶反应一(延迟反应)一(延迟反应)在O.l%TTC上生长利用天冬酿氨为唯一碳源和氮源自水杨背产酸黄单胞色素十十生长速度慢快硝酸盐还
16、原水解淀粉不水解水解液化明胶不能液化液化牛乳培养不能陈化可以陈化葡萄糖氧化和发酵。阿拉伯糖发酵不能利用，不产酸可以利用而产酸青霉素敏感不敏感丙氨酸为唯一碳源不生长生长0.001% CU(N03)2生长生长不生长注十为阳性反应，一为阴性反应。12 致病性测定如有需要，可进一步进行致病性测试。用灭菌棉签蘸取在SPA培养基上新鲜的菌落，转接于灭菌水中制备成107CFu/mL108 CFu/mL 的菌悬液，接种0.5mL于金刚30等易感水稻品种的水稻叶片，接种3株5株，同时接种阳性菌液和灭菌水做为阳性和阴性对照，2周4周后观察叶片，水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌典型病征参见B.6和C.6o13 结
17、果报告SPA未生长典型或疑似菌落，PCR结果阴性或ELISA检测阴性，相关生化鉴定不符合水稻细菌性条斑病菌或水稻白叶枯病菌的生理及生化特征的，报告为未检出水稻细菌性条斑病菌或未检出水稻白5 G/T 28078-2011 叶枯病菌。分离出的典型或疑似菌株PCR检测阳性或ELISA检测结果阳性，并通过生化鉴定符合水稻细菌性条斑病菌或水稻白叶枯病菌的生理及生化特征，报告为检出水稻细菌性条斑病菌或检出水稻白叶枯病菌。必要时可进行致病性测定。14 样品及分离物的保存保存样品由鉴定人标识确认、样品管理员登记，进行防虫处理后，阴性样品于阴凉干燥、防虫防鼠处妥善保存6个月。对检出水稻细菌性条斑病菌或水稻白叶枯
18、病菌的样本和分离菌株应在生物安全措施下至少保存1年，有特殊需求保存期可适当延长。保存期满，经灭活后妥善处理。分离菌株接种于SPA斜面上培养，4oc下可保存几周。菌株在10%20%甘油中或冻干，在一80oc条件下可长期保存。15 处理及生物安全措施对检出水稻细菌性条斑病菌或水稻白叶枯病菌的样品及其分离菌株、检测过程中的废弃物，需经有效的除害处理方式处理，以防止对环境的扩散。6 A.1 SPA培养基及配制方法A. 1. 1 成分蛋白陈蘸糖KzHP04 MgS04 .7HzO 琼脂蒸馆水A. 1.2 配制方法5.0 g 20.0 g 0.5 g 0.25 g 17.0 g 附录A(规范性附录)培养基
19、及试验方法1 000.0 mL pH 7. 27. 4 ,121 .C高压灭菌20min. A.2 革兰氏染色法A.2.1 结晶紫染色液结晶紫95%乙醇1%草酸镀水溶液1. 0g 20.0 mL 80.0 mL 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸镜溶液混合。A.2.2 草兰氏破液腆腆化饵蒸馆水1. 0g 2.0 g 300.0 mL GB/T 28078-20门将腆与腆化饵先进行混合，加入蒸锢水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸锢水至300mL。A.2.3 沙黄复染灌沙黄0.25 g 95%乙醇10.0 mL 蒸馆水90.0 mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馆水稀释。A.2.4 染色法A.
20、2. 4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。A.2.4.2 滴加革兰民染液，作用1min，水洗。7 G/T 28078-2011 . 2. 4. 3 滴加95%乙醇脱色，约30S;或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10So .3 鞭毛染色法.3.1 染色班的配制. 3. 1. 1 甲液:称单宁酸5g、氯化高铁(FeC13 ) 1. 5 g，溶于100mL蒸馆水中，待溶解后加入1%的氢氧化铀溶液1mL和15%的甲醒溶液2mL。. 3. 1. 2 乙液:称2g硝酸银溶于100.0mL蒸锢水中。在90.0mL乙液中滴加浓氢氧化镀溶液，到出现沉淀后，再
21、滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至遣清液中，至出现轻微雾状为止(此为关键性操作，应特别小心)。滴加氢氧化镜和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，2d3 d基本无效。.3.2 染色法在风干的载玻片上滴加甲液，4min6 min后，用蒸锢水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约半分钟(加热时注意勿便出现干燥面)。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检，菌体及鞭毛为深褐色到黑色。.4 明胶液化. 4.1 培养基蛋白陈牛肉膏明胶蒸馆水pH6. 87.。.4.2 制法5.0 g 3.0 g 120.0 g 1 000.0 mL 加热榕解、校
22、正pH7.47. 6，分装小管，121oC高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.87. 0。.4.3 试验方法用琼脂培养物穿刺接种，放在28t土1oC培养，每天取出，放冰箱内30min后再观察结果，记录液化时间。.5 氧化酶试验. 5.1 试剂. 5. 1. 1 1 %盐酸二甲基对苯二胶洛液:少量新鲜配制，于冰箱内避光保存。. 5. 1. 2 l%a-荼酣-乙醇溶液。GB/T 28078-2011 A.5.2 试验方法取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胶榕液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深;再加荼酣溶液一滴，阳性者于30s内呈现鲜蓝色。阴性于2min内不变
23、色。以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。A.6 硝酸盐培养基A. 6.1 成分KN03 蛋白豚蒸锢水pH7.4 A.6.2 制法0.2 g 5.0 g 1 000.0 mL 溶解，校正pH，分装试管，每管约5mL, 121 C高压灭菌15min。A. 6. 3 硝酸盐还原试剂A. 6. 3.1 甲液:将对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L乙酸榕液100mL中。A. 6. 3. 2 乙液:将甲荼胶0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。A.6.4 试验方法接种后在28C :l: 1 c培养3d5 d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时
24、于立刻或数分钟内显红色。A.7 过氧化氢酶试验A. 7.1 试剂3%过氧化氢溶液z临用时配制。A.7.2 试验方法挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。A. 7. 3 结果于30s内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。A.8 石莓牛乳培养基、配制方法及反应结果A. 8.1 培养基脱脂牛乳1 000.0 mL 石窟液(4%)15. 0 mL20. 0 mL 9 GB/T 28078-2011 A. 8.2 配制方法间歇灭菌3次，每次通气2却omin3切omin 石藤液的制备是将石3莓志浸泡在蒸锢水中过夜或更长的时间，溶解后过滤。A. 8. 3 反应
25、结果产酸:发酵乳糖产酸，使指示剂变为粉红色。产气:发酵乳糖而同时产气，可冲开上面的凡士林。凝固z因产酸太多而使牛乳中的醋蛋白凝固。陈化:将凝固的酷蛋白继续水解为陈，培养基上层液体变清，底部可留有未被完全陈化的酷蛋白。产碱:乳糖未发酵，因分解含氮物质，生成胶及氨，培养基变碱，指示剂变为蓝色。A.9 糖氧化和发酵培养基及配制方法A. 9.1 Hayward( 1964)培养基蛋白陈NH4H2P04 MgS04 .7H20 KCl 澳百里酣蓝(1.6%酒精溶液)H20 pH7.1 A.9.2 配制方法1. 0g 1. 0g 0.2 g 0.2 g 1. 5 mL 1000.0 mL 每支管分装9mL
26、灭菌，然后用无菌技术加入过滤灭菌或115oC , 10 min高压灭菌的10%糖溶液。A. 10 碳源利用培养基及配制方法A. 10. 1 5MB培养基Na2 HP04 2H20 KH2P04 NH4Cl K2HP04 MgS04 .7H20 5%拧攘酸铁镀0.5%CaC12 琼脂蒸馆水pH7.0 A. 10.2 配制方法4.75 g 0.5 g 1. 0g 4.53 g 0.5 g 1. 0 mL 1. 0 mL 17.0 g 900.0 mL 121 oC灭菌20min，在基本培养基中加入过滤除菌或115oC , 20 min灭菌的氨基酸，使其终浓度为0.2%。A. 11 水杨苦产酸试验培
27、养基及配制方法A. 11. 1 Ayers培养基及配制方法A. 11. 1. 1 培养基NH4HzP04 MgS04 .7HzO KCl NaCl 蒸馆水澳百里酣蓝(1.6%酒精溶液)pH7. 0 ,121 .C灭菌20min. A. 11. 1.2 配制方法1. 0g 0.2 g 0.5 g 5.0 g 1 000.0 mL 1. 5 mL 必要时可补充0.2g酵母音以促进细菌生长。A. 11. 2 Dye培养基C及配制方法A. 11. 2. 1 培养基NH4HzP04 MgS04 .7HzO KzHP04 NaCl 酵母晋琼脂澳百里酷蓝(1.6%酒精溶液Hz。A. 11. 2. 2 配制方
28、法0.5 g 0.2 g 0.5 g 5.0 g 1. 0g 17.0 g 1. 5 mL 1 000.0 mL GB/T 28078一-2011pH7. 0 ,121 .C灭菌20min.待测定的水杨昔单独灭菌或过滤除菌，在培养基中的最终添加浓度为1%。产酸培养基变为黄色，产碱则变为蓝色。11 GB/T 28078-20门附录B(资料性附录)水稻细菌性条斑病菌基本信息B. 1 中文名水稻细菌性条斑病菌(水稻黄黄单胞菌水稻生致病变种;黄单胞菌条斑致病变种)。B.2 学名Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Fang et al.) Swings et al. 异名
29、:Xanthomonas camestris pv.oryzicola (Fang et al) Dye; Xanthomonas translucens f. sp. oryzicola (Fang et al. ) Bradbury B.3 病害英文名bacterial leaf streak of riceo B.4 分布亚洲z孟加拉、柬埔寨、中国、印度、印尼、老挝、马来西亚、缅甸、尼泊尔、巴基斯坦、菲律宾、泰国、越南;非洲:马达加斯加、尼日利亚、塞内加尔;大洋州z澳大利亚。B.5 寄主范围水稻Oryzasativa、肌子草Leptochloa卢liformis、雀碑Paspalumsc
30、robiculatum、沼生蔬Zizaniaplustris、结缕草Zoysiajaonica、假稻属Leers町、稻属OryzaoB.6 症状病斑在叶尖、叶缘发生。也可在中肋两侧发生，叶鞠发生较少。病斑初呈暗绿色水渍状半透明的小点，沿叶脉扩大成为宽四分之一至三分之一，长lmm4mm的水渍状条斑。以后还可继续扩大，颜色由黄褐转橙褐色，但两段仍呈暗绿色，对光观察叶片，条斑呈半透明状。病斑上常泌出许多露珠状的蜜黄色菌服。严重时，许多条斑融合、连接在一起，成为不规则的黄褐色至枯白色大斑块，外形与自叶枯有点相似。病情严重时叶片卷曲，远望呈现一片黄白色。B.7 分类地位及生理生化特性水稻细菌性条斑病是由
31、黄单胞菌条斑致病变种(Xa7叫omonasoryzae pv. oryzicola)病原菌引起，该菌属原核生物界(Procaryotae)、变形菌门(Proteobacteria)、丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、黄单胞菌属(Xanthomonas)。GB/T 28078-2011 病原菌菌体单生，短杆状，大小(1.0m2.0m)X(0.3m0.5m)，少数成对但不成链状，不形成芽抱英膜，极生鞭毛一根。革兰氏染色阴性，在NA培养基上菌落呈蜜黄色，圃形，边缘整齐，光滑发亮，秸稠，
32、好气。最适生长适温28.C30 .C，生理生化反应与自叶枯菌相似，不同之处该菌能使明胶液化，使牛乳陈化，使阿拉伯糖产酸，对青霉素、葡萄糖反应不敏感，它可产生3-援基丁酣，以L-丙氨酸为唯一碾源，在0.2%元维生素酷蛋白水解物上生长，以及对0.001%CU(N03)2有抗性，这些特点可与白叶枯病菌相区别。该菌与水稻白叶枯病菌的致病性和表现性状虽有很大不同，但其遗传性及生理生化性状又有很大相似性。B.8 传播途径和发病条件病田收获的种子、病残株带病菌，为下季初侵染的主要来源。病粒播种后，病菌侵害幼苗的芽黯和叶梢，插秧时又将病秧带人本田，主要通过气孔侵染。在夜间潮湿条件下，病斑表面溢出菌浓。干燥后成
33、小的黄色株状物，可借风、雨、露水、泌水叶片接触和昆虫等蔓延传播，也可通过灌溉水和雨水传到其他田块。远距离传播通过种子调运。13 GB/T 28078-20门附录C(资料性附录)水宿臼叶枯病菌基本信息C.l 中文名水稻白叶枯病菌(稻生黄单胞菌:水稻黄单胞菌白叶枯致病变种)。C.2 学名Xanthomonas oryzae pv. oryzae Clshiyama) Swings et al. 异名:Pseudomonas oryzae lshiyama; Xanthomonas cam pestris pv. oryzae Clshiyama) Dye; Xan thomonas itoana
34、CTochinai) Dowson; Xanthomonas kresek Schure; Xanthomonas translucens f. s户.oryzae Clshiyama) Pordesimo。C.3 英文名bacterial blight of rice; bacterial leaf blight of rice C.4 分布亚洲:孟加拉、柬埔寨、中国、印度、印尼、伊朗、日本、朝鲜、韩国、老挝、马来西亚、缅甸、尼泊尔、巴基斯坦、菲律宾、斯里兰卡、中国台湾、泰国、越南;非洲:布基纳法索、喀麦隆、加蓬、马里、尼日尔、塞内加尔、多哥、西非;美洲:玻利维亚、中美洲、哥伦比亚、哥斯达黎
35、加、厄瓜多尔、萨尔瓦多、洪都拉斯、墨西哥、巴拿马、美国、委内瑞拉F大洋州:澳大利亚。C.5 寄主范围水稻COryzasativa)、蓉草CLeersiaoryzoides)、肌子草CLeptochloapanicea)、雀碑CPasalumscrobiculatum)、沼生部CZizaniaalustris)、结缕草CZoysia jaonica)、稻属COryza)、假稻属CLeersia)、千金子属CLeptochloa)、蔬属CZizania)。C.6 症状水稻各个器官均可染病，叶片最易染病。其症状因病菌侵入部位、品种抗病性、环境条件有较大差异，常见分3种类型。叶枯型z主要为害叶片，严重
36、时也为害叶鞠，发病先从叶尖或叶缘开始，先出现暗绿色水浸状线状斑，很快沿线状斑形成黄白色病斑，然后沿叶缘两侧或中肋扩展，变成黄褐色，最后呈枯白色，病斑边缘界限明显。在抗病品种上病斑边缘呈不规则波纹状。感病品种上病叶灰绿色，失水快，内卷呈青桔状，多表现在叶片上部。急性凋萎型:苗期至分囊期，病菌从根系或茎基部伤口侵入维管束时易发病。主茎或2个以上分囊GB/T 28078-20门同时发病，心叶失水青枯，凋萎死亡，其余叶片也先后青枯卷曲，然后全株枯死，也有仅心叶枯死。病株茎内腔有大量菌脏，有的叶黯基部发病呈黄褐或褐色，折断用于挤压溢出大量黄色菌脏。有的水稻自分囊至孕穗阶段，剑叶或其下1叶3叶中脉1炎黄色
37、，病斑沿中脉上下延伸，上可达叶尖、下达叶销，有时叶片折叠，病株未抽穗而死。褐斑或褐变型:抗病品种上较多见，病茵通过剪叶或伤口侵入，在气温低或不利发病条件，病斑外围出现褐色坏死反应带，病情扩展停滞。黄化型症状不多见，早期心叶不枯死，上有不规则褪绿斑，后发展为枯黄斑，病叶基部偶有水浸状断续小条斑。天气潮湿或晨露未干时上述各类病叶上均可见乳白色小点，干后结成黄色小胶粒，很易脱落。水稻白叶枯病造成的枯心苗，在分囊期开始出现，病株心叶或心叶以下1层2层叶出现失水、卷筒、青枯等症状，最后死亡。白叶枯病形成枯心苗后，其他叶片也逐渐青枯卷缩，最后全株枯死，剥开新青卷的心叶或折断的茎部或切断病叶，用力挤压，可见
38、有黄臼色菌服滥出，即病原菌菌肤，别于大惧、二化蟆及三化蟆为害造成的枯心苗。C.7 分类地位及生理生化特性水稻白叶枯病是由水稻黄单胞菌白叶枯致病变种CXanthomonasoryzae pv.oryzae)病原菌引起。该病原菌属原核生物界CProcaryo tae)、变形菌门(Protcobacteria)、丙型变形菌纲(Gammaproteobacte ria)、黄单胞菌目CXanthomonadales)、黄单胞菌科CXanthomonadaceae)、黄单胞菌属CXanthomonas)。病原菌菌体为短杆状，两端钝圆，大小为(1，0m2.0m)X(0.8ml.Om);单鞭毛极生，长6m8m
39、;不形成芽抱和英膜，但在菌体表面有一层胶质分泌物。在琼脂培养基上生长缓慢，菌落呈蜜黄色或淡黄色，圆形，边缘整齐，质地均匀，表面隆起，光滑发亮，兀荧光，有蒙古性。革兰氏染色阴性。好气性、代谢呼吸型。不水解淀粉和明胶;能使石犀牛乳变红，但不凝固;不还原硝酸盐;产生氮和硫化氢，不产生呵|味;能利用荒糖、葡萄糖、木糖和乳糖发酵产酸，但不产气。一般不利用元机氮和硝态氮，只能利用部分氨态氮。在含3%葡萄糖或20mg/kg青霉素的培养基上不能生长。生长温度范围为5 oC40 oC，最适温度26oC 30 oC。致死温度在无胶膜保护下为53oC 10 min;在有胶膜保护下为57 oC 10 mino病菌最适
40、宜pH6.57. 0。C.8 传播途径和发病条件带菌种子、带病稻草和残留田间的病株稻桩是主要初侵染源。李氏禾等田边杂草也能传病。细菌在种子内越冬，播后由叶片水孔、伤口侵入，形成中心病株，病株上分泌带菌的黄色小球，借风雨、露水、灌水、昆虫、人为等因素传播。病菌借灌溉水、风雨传播距离较远，低洼积水、雨涝以及灌漫灌可引起连片发病。晨露未干病田操作造成带菌扩散。高温高湿、多露、台风、暴雨是病害流行条件，稻区长期积水、氮肥过多、生长过旺、土壤酸性都有利于病害发生。15 GB/T 28078-2011 附录D(规范性附录)水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的PCR检测方法D.1 试剂及配方D. 1.1 D
41、NA抽提液配方100 mmol/L Tris-HCl, pH8. 0 250 mmol/L NaCl D. 1.2 CTAB沉淀液配方1%CTAB(质量浓度)(十六烧基三乙基澳化镀)50 mmol/L Tris-HCl, pH8. 0 10 mmol/L EDTA,pH8. 0 D. 1.3 TE缓冲液配方10 mmol/L Tris-HCl, pH8. 0 1 mmol/L EDTA,pH8. 0 D. 1. 4 TAE电泳缓冲擅(pH8.5)配方(50X) Tris NazEDTA.2HzO 242 g 37.5 g 100 mmol/L EDT A 100g/mL蛋白酶K冰乙酸蒸馆水57
42、.1 mL 1000 mL D.1.5 10X电泳上样缓冲液(pH8.5)配方20%(质量浓度)Ficoll400 1.9%(质量浓度)SDSo. 1 mol/L Naz EDT A(pH8. 0) 0.25% (质量浓度)澳酣蓝D.2 细菌DNA的提取将制备好的菌悬液移至一干净灭菌的离心管中，12000r/min离心15min，弃上清液。在沉淀中加人TE缓冲液5mL，10%SDS溶液300L，20mg/mL蛋白酶K30L，混匀，370C水浴孵育1h。加入等体积的三氯甲烧异戊醇(24: 1)，混匀。10000 r/min离心5min，将上清液移至一个新离心管中。加入等体积酣-三氯甲皖-异戊醇(
43、25:24:1)，混匀，10000 r/min离心5min，将上清液移至一新离心管。加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，10000r/min离心5min，弃上清液，管中加入70%乙醇洗涤沉淀，晾干，加入50LTE缓冲液溶解DNA沉淀，一200C长期保存。注:此步骤可省略。可直接用培养的菌株稀释成;:105CFU/mL的菌悬液做模板进行定性PCR检测。D.3 定性PCR检测D. 3.1 PCR反应体系D. 3. 1. 1 检测水稻自叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌采用的PCR引物序列见表D.1。G/T 28078-2011 表D.1检测水稻自叶桔病菌和水稻细菌性条斑病菌的PCR引物引物序列正向引物:
44、5 -GAAT ATCAGCATCGGCAACAG-3 反向引物:5人TACCGGAGCTGCGCGTT -3 PCR产物大小152 bp 含铁细胞接受因子基因D. 3. 1. 2 检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌采用的PCR反应体系见表D.2。表D.2检测水稻白叶枯病菌和水韬细菌性条斑病菌的PCR反应体系组成加样体积10XPCR缓冲液(Mg2-t-free) 2.5L 氯化簇(25mmolhLL) 2L dNTP(1 0 mmol/L) 0.5L Taq酶(1U/I-L) 0.7L 正向引物(10pmol/L) 1.5L 反向引物(10pmol/L) 1.5L 模板DNA(1ng/L-
45、10 ng/L) 5L 双蒸水11. 3L 总体积25L D. 3. 2 PCR反应循环参数94 .C预变性3min;94 .C , 30 的59.C , 30 s;72 .C , 20 s，进行30个循环;72 .C延伸5min，并置于4 .C保存。D. 3. 3 PCR扩增产物的栓副用TAE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝肢，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR产物，将混有上样缓冲液的PCR扩增产物加至样品孔中，用DNAMaker做相对分子质量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像分析仪下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍摄并记录实验结果。17 GB/T 28078-2011 附录E
46、(资料性附录)黄单胞菌属CXanthomonas)和假单胞菌属CPesudomonas)主要生化差别表E.1 Xanthomonas属和Pesudomonas属之间的主要表型差异主要特征Xanthomonas Pesudomonas 氧化酶反应一延迟反应)+ 在O.l%TTC上生长十利用天冬酿氨为唯一碳源和氮源+ 自水杨昔产酸十黄单胞色素+ 18 =oN|hoNH阁。华人民共和国家标准水稻自叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检症鉴定方法GB/T 28078-2011 国白* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销导开本880X 1230 1/16 印张1.5字数36千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷峰书号:155066. 1-44634 24.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28078-2011 打印日期:2012年5月22日F002
