1、ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民圭七./、和国国家标准GB/T 28081-2011 烟草环斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of tobacco ringspot virus 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 28081-20门目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检
2、疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人:陈青、林石明、杨翠云、张毅、陈红运、廖富荣、郑云、李斌。I GB/T 28081-20门烟草环斑病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了烟草环斑病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本标准造用于可能携带烟草环斑病毒的种子、苗木、鳞球茎、组培苗等繁殖材料及其产品的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1146 植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法。3 烟草环斑病毒
3、基本信息中文名:烟草环斑病毒。学名:tobacco ringspot virus 0 缩写:TRSV。属豆豆花叶病毒科Comoviridae，线虫传多面体病毒属Neovirus病毒。TRSV的传播途径多样，可以通过种子、嫁接、机械接种和介体传播。烟草环斑病毒其他信息参见附录A。4 方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DA5-ELISA)、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定。5 仪器设备、用具及试剂5. 1 仪器设备洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平(感量O.001 g)、超净工作台、旋涡混合仪、PCR仪、实时荧光PCR
4、仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、榨汁机、水洛锅。5.2 用具微量移液器(0.5L，2L，10L，20L，100L，200L，1000L)、化学PCR反应管和(或)96孔光化学PCR反应板、酶联板、研钵。5.3 试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂(见B.1)。1 GB/T 28081-2011 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测试剂(见C.1)。实时荧光RT-PCR检测试剂(见D.l)。IC-RT-PCR检测试剂(见E.1)。6 种茵的检测鉴定6. 1 种子检测鉴定挑取500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，待长出3片4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10
5、株为1组并编号。采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。6.2 苗木、组培苗检测鉴定有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同6.106.3 鳞球茎检测鉴定取鳞球茎的小芽或鳞片进行酶联测定和分子生物学检测。6.4 植物产品的检测鉴定植物产品有症状的部分单独检测。没有症状或元法的观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测。7 检测7. 1 双抗体夹心酶联免疫眼附测定把制备的样品上清液加人已包被TRSV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品平行加到两个孔中。
6、健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如z种子或叶片)应尽量与检测样品相一致。具体操作见附录B。7.2 RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录C。7.3 实时荧光PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行实时荧光PCR检测。健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录D。7.4 IC-RT-PCR检测把制备的样品上清
7、液加入己包被TRSV抗体的离心管中，然后进行IC-RT-PCR扩增。健康的植2 GB/T 28081-20门物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录E。8 结果判定7.1、7.2、7.3、7.4中如果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种苗携带烟草环斑病毒。一般是酶联测定为阳性后，分子生物学检测为阳性即可判断为携带有烟草环斑病毒。必要时可进行生物接种试验，具体操作按照SN/T1146规定的方法执行。9 样品保存、结果记录与资料保存9. 1 样晶保存经检验确定携带烟草环斑病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4oC，病株在一200C或者-80oC
8、冰箱中保存，做好标记和登记工作。9.2 结果记录与资料保存完整的实验记录包括:样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经于人和检测人员的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片。3 GB/T 28081-2011 A.1 寄主范围附录A(资料性附录)烟草环斑病毒简介TRSV自然寄主范围非常广泛，可侵染54科300多种植物，主要的经济作物有:大豆CGlycinemax)、马铃薯CSolanum tuberosum)、甘薯(Iomoeabatatas)、烟草CNicotiana tabacum)、西瓜(Citrullus lana
9、tus)、黄瓜(Cucumis sati vus )、甜瓜(cucumismelo)、胡萝卡(Daucuscarota)、唐富蒲(Gladious cummunis)、李属(PruusL.)、葡萄(Vitislinifera)等。A.2 病害症状因寄主不同可产生不同的症状，一般在生长季节初始，幼嫩植株上的症状较严重，而在生长季节后期不太明显。TRSV造成叶片系统褪绿斑、坏死环斑，茎顶枯，根腐烂，危害严重时导致植株矮化，结果少和果实变小畸形。有的症状在后期可恢复，表现为无症带毒。大豆:顶芽卷曲(芽枯萎)，其他芽逐渐变褐色且易碎。在茎干和多数叶片的叶柄上产生褐色条纹，豆英不发达且结实。在结英后感染
10、则可能产生黑色污点。烟草:在叶片上产生环形及线状斑，植株矮化。葫芦:植株矮化、叶片斑驳、果实畸形。葡萄:新长出的枝条柔弱、稀疏，节间变短。叶小且扭曲，植株矮小、产果少且变形。A.3 分布地区TRSV在日本、韩国、印度、中国台湾地区、美国、土耳其、加拿大、墨西哥、阿根廷、巴西、澳大利亚、新西兰等50多个国家和地区均有分布。A.4 传播途径TRSV在大豆上的种传率有时可达到100%。主要的传播介体为美洲剑线虫Xiphinemaameri canum。此外在实验室条件下确定能传播TRSV的昆虫介体有许多，如烟萄马Thri如tabaci和烟草跳甲Epitrixhirtiennzs等。A.5 血清学特性
11、TRSV免疫原性强。A.6 粒体形态病毒粒体为等轴二十面体球状颗粒，直径约28nmo 4 GB/T 28081-2011 A.7 基因组病毒基因组含两条ssRNAoRNA-1长7514nt，RNA-2长3929nt，外壳蛋白基因1548 nt。5 GB/T 28081-2011 附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免瘟眼附测定B.1 试剂B. 1. 1 包被抗体特异性的烟草环病毒抗体。B. 1.2 酶标抗体碱性磷酸醋酶标记的烟草环斑病毒抗体。B. 1.3 底物对硝基苯磷酸二锅(pNPP)B. 1.4 样晶抽提缓冲波(pH7.4)PT lL NaZS03 1. 3g PVP(MW24 00040
12、000) 20 g NaN3 0.2 g 用NaOH或HCl调节pH值到7.404.C储存。B. 1.5 包被缓冲撞(pH9.6)NaZC03 NaHC03 1. 59 g 2.93 g NaN3 0.2 g 加入900mL蒸锢水溶解，用HCl调节pH值到9.6，蒸锢定容至1L. 4.C储存。B. 1.6 PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4)NaCl 8.0 g NazHP04 1. 15 g KHzP04 0.2 g KCl 0.2 g Tween-20 0.5 mL 加入900mL蒸馆水榕解，用NaOH或HCl调节pH值到7.4，蒸馆水定容至lL。每升PBS中加入0.5mL的Tween-
13、20.B. 1.7 酶标抗体稀释缓冲渣(pH7.4)PBST 1 L BSA(牛血清白蛋白或脱脂奶粉2.0 g 6 GB/T 28081-20门PVPCMW24 00040 000) 20.0 g NaN3 0.2 g 用NaOH或HCl调节pH值到7.4，40C储存。B. 1.8 底物CpNPP)缓冲渣CpH9.8)MgClz NaN3 二乙醇胶0.1 g 0.2 g 97 mL 溶于800mL蒸馆水中，用HCl调pH值至9.8，蒸锚水定容至1Lo 40C储存。B.2 程序B.2.1 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100L/孔，加盖，室温避光孵育4h或40C冰箱孵育
14、过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4次6次。B.2.2 样晶制备待测样品按1: 10C重量:体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r/min，离心10min，上清液即为制备好的检测样品。样品提取缓冲液作空白对照，阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B.2.3 加样加人制备好的检测样品、空白对照、阴性对照、阳性对照，100L/孔，加盖，室温避光孵育2h或40C冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4次6次。B. 2. 4 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100L/孔，加盖，室温避光孵育2h，清空酶联板孔中榕液，PBS
15、T洗涤4次6次。B.2.5 加底物将底物NPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mLC现配现用)，按100L/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。B.2.6 读数用酶联检测仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值。B.3 结果判断B.3.1 对照孔的OD45Q值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即:缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值2;孔的重复性基本一致。B.3.2 在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下:7 G/T 28081-2011 8 样品OD405值/阴性对照OD405值明显2，判为阳性。样品OD405值/阴性对照OD删值在阔值附近，判为可
16、疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。样品OD405值/阴性对照OD405值明显2，判为阴性。若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断。C.1 试剂附录C(规范性附录)RT-PCR检测C. 1. 1 TRlzol reagent、三氯甲:皖、异丙醇、70%乙醇。GB/T 28081-2011 C. 1.2 反转录试剂:M-MLV反转录酶(200U/flL)、5XRT反应缓冲液(250mmol/L Tris-HCl pH8.3 25 oC、375mmol/L KCl、15mmol/L MgC12 , 5D mmol!L DTT) , dNTP 71昆合液(各10mmol/L)、RN
17、ase Inhibitor(40 U/L)。c. 1. 3 PCR试剂:lOXPCR缓冲液(含15mmol/L的Mg2-1-)、TaqDNA聚合酶(5U/flL)、dNTP混合液(各10mmol/L)。C.2 实验步骤C. 2.1 引物设计根据已报道的TRSVCP基因的保守序列设计1对特异性引物:引物序列为:TRSVF-1: 5 -GA TGCAAAGAAAGGAAAGC-3 TRSVR-1 : 5 -AG A T A TGG ACAACA TGG AG-3 扩增片段大小为576峙。C.2.2 RNA提取C. 2. 2.1 取0.1g样品，波氮研细，加入l皿LTRlzol r国gt，混匀，倒入
18、1.5 mL离心管中，室温静置3 min。C.2.2.2 加入0.2mL三镇甲烧，剧烈振荡15s，室温静置3min, 4 oC 11 000 r/min离心10min.小心吸取上层元色水相到新离心管中。C. 2. 2. 3 加入等体积异丙醇，混匀，一200C静置10min.4 oC 12000 r/min离心15min.弃上清液。C. 2. 2.4 加入1mL 70%冷乙醇，悬浮沉淀.4C8000 r/min离心10min，干燥沉淀。C.2.2.5 加入30LDEPC处理的ddHzO，溶解沉淀(必要时，55oC60 oC7j(浴10min，加速溶解), 于一800C保存备用。注s也可按照商品R
19、NA提取试剂盒进行操作。C. 2. 3 反转录利用提取的RNA在PCR管中进行反转录。先加入2L的总RNA、1L的TRSVR-1引物(10mOl/L) ，于950C的水浴中7min，然后迅速冰浴5mino继续加入5XRT缓冲液2.5L、dNTP混合液(10mmol/L)O. 5L、M-MLV反转录酶(200U/flL)O. 5L、RNaseInhibitor O. 5L、DEPC处理的ddH205.5L。反应参数:37oC60 min , 95 oC10 mino合成的cDNA于一200C冰箱保存备用。C. 2. 4 PCR扩增PCR反应体系见表C.1。反应条件:940C4 min;94 oC
20、 45 s、480C45 s、720C45 s，30个循环;72oC 延伸10min。9 GB/T 28081-20门表C.1PCR反应体系名称10XPCR缓冲液(含15mmol/L的Mg2+)dNTP混合液各10mmol/L) TRSVF-1(20 pmol/L) TRSVR-1(20 pmol/L) Taq酶(5U/lL) cDNA C.2.5 琼脂糖凝股电泳检测C. 2. 5.1 制备凝胶加样量L 2.5 l. 0 0.5 0.5 0.3 3 补ddH，O至25L配制1.5%(质量浓度)的琼脂糖凝肢。澳化乙键可直接加入琼脂糖凝胶中(浓度为O.5g/mL) , 也可在电泳完成后用澳化乙链染
21、色。C.2.5.2 电泳用1L6X加样缓冲液与5L样品濡合，然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加入到琼脂糖凝胶孔中。接通电源，以3V / cm 5 V / cm电场强度进行电泳，约0.5h后观察结果。C.2.5.3 结果观察电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入装有0.5g/L的漠化乙键(EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。C.3 结果判断阳性对照在576bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照、阴性对照和空白对照正确，样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为阴性。10 D
22、.1 试剂试剂见C.1oD.2 实验步骤D. 2.1 引物设计引物序列:附录D(规范性附录)实时荧光RT-PCR检测TRSV-5P: 5 -TCCA TGTTGTCCAT A TCTTA-3 TRSV-3P: 5 -AGAAGAAACACTCTTGACACT-3 , 探针序列:5 -FAM-CCGCTTATAGTGCCAGACCA-TAMARA-3 , D.2.2 RNA提取及反转录操作方法见C.2. 20 D. 2. 3 实时荧光PCR反应体系GB/T 28081-20门实时荧光PCR反应体系见表D.l.每个样品设2个平行处理。并设阳性对照、阴性对照和空白对照，以含有烟草环斑病毒的cDNA为
23、阳性对照;以健康植物材料或线虫传多面体病毒属其他病毒的cDNA作为阴性对照;以ddH20代替DNA模板作为空白对照。每个对照各做2个平行管。表D.1实时荧光PCR反应体系名称贮备液浓度终浓度加样量L PCR缓冲液10X lX 5 TRSV-5P 20 flmol/L 0.24mol/L O. 6 TRSV-3P 20mol/L 0.24mol/L O. 6 Taq酶5 U/L 2 U/test 0.4 探针20mol/L 0.4mol/L cDNA 4 ddH20 补ddH20至50LD.2.4 实时荧光PCR反应参数反应条件:940C5min;940C 15s, 550C 40s, 720C
24、 40s，共40个循环。点击运行，进行PCR反应，GB/T 28081-20门保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出t，Rn(荧光信号增加值)与循环数之间关系的图像。D.3 结果判定检测样品的Ct值大于或等于40时，则判定烟草环斑病毒阴性。检测样品的Ct值小于或等于35时，则判定烟草环斑病毒阳性。检测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值大于或等于40时，则判定烟草环斑病毒阴性;如果重新测试的Ct值小于40，则判定烟草环斑病毒阳性。12 E.1 试剂E. 1. 1 TRSV抗体。E. 1.2 样品抽提缓冲液(见B.l.的。E. 1.3 包被缓冲液(见
25、B.l. 5)。E. 1. 4 PBST缓冲液(见B.l.的。附录E(规范性附录)IC-RT-PCR检测E. 1.5 反转录及PCR试剂(见C.l. 2、C.l. 3)。E.1.6 AMV反转录酶。E. 2 实验步骤E. 2.1 引物引物序列见C.2.LE. 2. 2 抗体吸附GB/T 28081-20门将TRSV抗体用包被缓冲液作适量稀释，吸取200L包被离心管，37oC，孵育2h;用PBST洗3次，取样品50mg，加入样品抽提缓冲液进行研磨，吸取100L包被PCR管，40C过夜(或370C孵育2 h) ;PBST洗3次，DEPC-H20洗1次，短暂离心后吸去管底余液。E. 2. 3 反转录
26、直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录。反转录体系总体积20L，其中1L反向引物(20mol/L) ，4L 5XAMV酶缓冲液，2LdNTP (10 mmol/L) , 11L DEPC-H20o离心混匀后950C变性5min，迅速置冰上2min3 min，然后加入1LAMV反转录酶(5U/-l L) , 1LRNA酶抑制剂(40U/L) ,42 oC反应1ho E. 2. 4 PCR扩增和琼脂糖凝胶检测操作方法见C.2.4、C.2. 5。E. 3 结果判断阳性对照在576bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照、阴性对照和
27、空白对照正确，样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为阴性。13 FFON-ONH白。华人民共和国家标准烟草环斑病毒检瘦鉴定方法GB/T 28081-2011 国由t非中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1.25 字数27千字2012年5月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2012年5月第一版峰书号:155066. 1-44637 21. 00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28081-2011 打印H期:2012年5月22H F002
