1、ICS 65.020.01 B 16 道昌国家标准国不日11: -、中华人民G/T 28082-2011 榆枯萎病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Ophiostoma novo-ulmi Brasier and Ophiostoma ulmi (Buisman) Nannf. 2011-12-30发布2012-06-01实施量生鹊!坊伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布.L. - 目。昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草
2、单位:中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:吴品珊、严进、杜洪忠。GB/T 28082-2011 I G/T 28082-20门榆枯萎病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了榆枯萎病菌的分离培养、形态学鉴定的方法。本标准适用于来自榆枯萎病菌有发生国家和地区的榆属CUlmusL. )苗木、原木、木制品和木包装中榆枯萎病菌的检疫鉴定。2 榆枯萎病菌基本信息中文名:揄枯萎病菌。学名:0hiostomanovo-ulmi Brasier; Ophiostoma ulmi CBuisman) Nannf.。异名:CeratocystisulmiCBuism. )Moreauo 病害英文名:dutch e
3、lm disease, elm wi1t disease 0 属真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，子囊菌纲Ascomycetes，粪科菌亚纲Sordariomycetidae，长朦壳目Ophiostomatales，长朦壳科Ophiostomataceae，长朦壳属。hiostoma。榆枯萎病菌其他信息参见附录A。3 方法原理依据元性抱子和有性世代的形态特征和生物学特性，以及其对寄主造成的症状特征进行检测鉴定。4 仪器4. 1 生物显微镜。4.2 体视显微镜。4.3 光照生物培养箱。4.4 高压灭菌器。4.5 超净工作台。4.6 电子天平。4. 7 摇床。5 试剂和培养基5. 1
4、 试剂琼脂粉，麦芽膏，Oxoid麦芽提取物，榆树枝条，葡萄糖，天门冬酷胶CL-asparagine) ，磷酸二氢饵CKH2P04) ，硫酸镜CMgS04.7H20)，硫酸钵CZnS04)，三氯化铁CFeC13)，维生素BJ，维生素民，放线菌酣，链霉素，青霉素。注:放线菌嗣为剧毒品，注意防护。1 G/T 28082-2011 5.2 培养基5.2. 1 选择性培养基0.2 g放线菌酣溶于100mL水，取50mL加于1000mL麦芽音(MA)培养基内，灭菌后冷至45OC , 加入10mL含1%链霉素和1%青霉素的混合液。5.2.2 麦芽膏培养基MA25 g麦芽膏，17g琼脂粉，1000mL蒸馆水，
5、灭菌。5.2.3 揄边材培养基ESA取50g健康的榆树边材或枝条，去皮粉碎成直径。.5cm的小块，15g琼脂粉，500mL蒸馆水，灭菌。5. 2. 4 Tchernoff改良培养液20 g葡萄糖、2g天门冬酷胶、1.5g磷酸二氢饵、1g硫酸臻、20mg硫酸辑、10mg三氯化铁、1mg 维生素Bl和1mg维生素队，1000mL蒸馆水，灭菌。5.2.5 Oxoid麦芽提取物培养基MEA33 g Oxoid麦芽提取物，10g琼脂粉，1000mL蒸馆水，灭菌。6 标准菌株。hiostomanovo-ulmi A交配型(Amating type) ，雌性;B交配型(Bmating type) ，雄性。0
6、hiostoma ulmi A交配型(Amating typc) ，雌性;B交配型(Bmating type) ，雄性。中国检验检疫科学院保存病商的标准菌株。7 检测检查苗木、原木或木材的表面，纵向和横向切开树干或枝条检查。榆枯萎病菌的2个种引起的外观症状是相同的。在树干或枝条的横切面上，可见靠近外面的年轮附近有深褐色斑点或条纹，有时斑点密集，可连成断续的深褐色圆环。去掉树皮，木质部上有深褐色纵向条纹，有时条纹不明显，可轻削一层木质，条纹便显现出来。切开枝权处，常可找到小蠢的蛙食槽。取有如下症状的样品做病菌分离:干枯呈深褐色的枝条，有小盐蛙食槽痕迹的树皮，横断面上有深褐色斑点或断续的褐色困环枝
7、干，纵切面有褐色条纹枝干，货物上附着有小蠢虫。8 鉴定8. 1 分离培养对变色的木质部，去掉树皮，切取直径为5mm大小，于选择性培养基(见5.2.1)上，200C黑暗培养;对有虫蛙槽的树皮，清除蛙槽内的虫粪和残屑，70%酒精消毒10s30 s，元菌水冲洗，灭菌滤纸吸干水分，切取边长为5mm10 mm的大小，于选择性培养基上，200C黑暗培养;小蠢虫解肢为5mm大小，70%酒精消毒10s30 s，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干水分，于选择性培养基上，200C黑暗培养。一2 GB/T 28082-2011 旦有真菌菌落出现，立即分别转皿。转皿到ESA培养基，20.C培养，以期获得粘束梗霉Pesotumu
8、lmi ;转接于TchernoH改良培养液中，室温下110r/min振荡培养，以期获得酵母状分生抱子Blastomyces;转皿到MEA培养基，20.C黑暗培养，以做种的鉴定。8.2 子囊拍子培育子囊抱子需在A、B型2种交配型同时存在的ESA培养基上形成。如确认在ESA培养基上长出褐色粘束梗霉，同时取0hiostomano7.阶ulmi(任意亚种)和0hiostomaulmi标准菌株的A、B交配型，分别与分离出的病菌，等距离三角形接种在ESA培养基上，各重复3皿，20.C黑暗培养7d，然后室温(20.C25 .C)漫射光下继续培养14d。8.3 种的鉴定菌落形态、菌落生长速度和最佳生长温度，是
9、区分揄枯萎病菌两个种的主要指标。取在MEA培养基上培养的新鲜菌块(2mm大小)，转接在MEA培养基中央，共转6皿，3皿置于20.C黑暗培养，3皿置于33.C黑暗培养。20.C黑暗培养2d后，取出培养皿测量菌落直径队，继续在20.C黑暗培养5d，再次测量菌落直径队，按(1-o)/5计算病菌5d的平均辐射状生长速度(mm/d)。最后将培养皿置于室温，漫射光继续培养10d，以观察菌落特征。33.C黑暗培养2d后，取出培养皿测量菌落直径Eo，继续在33.C黑暗培养3d，再次测量菌落直径EI按(E1-Eo)/3计算待测菌3d的平均辐射状生长速度(mm/d)。最后将培养皿置于室温，漫射光继续培养10d，以
10、观察菌落特征。必要时做亚种鉴定(参见附录B)。9 结果判定9. 1 Ophiostoma novo-ulmi 9. 1. 1 菌落特征在MEA培养基上，经20.C黑暗7d和室温漫射光10d培养后，菌落灰白至乳白色，花瓣状、轮纹明显。气生菌丝量中等，常结集成绳索状使菌落有条纹呈现。欧亚亚种o.novo-ulmi subsp. novo-ulmi 的菌落条纹较少，边缘有不规则的叶状浅裂。.novo-ulmi在20.C黑暗条件下生长较快。生长速度为(2.3 mm/d )3. 1 mm/d4. 3 mm/d( 5.7 mm/d) , 33 .C的生长速度为(0mm/d)O.l mm/dO. 5 mm/
11、d。9. 1. 2 病菌形态菌丝:分隔，直径1m6m，气生菌丝常结集成绳索状，菌丝体分生抱子丰富。粘束梗霉Pesotumulmi :易在ESA培养基上形成。柬丝元性态(synnematalanamorph)单个或多个，褐色到黑色，纤细，lmm2mm长;褐色假根状菌丝附着在培养基上，褐色有隔菌丝平行构成束状，顶部张开分枝成透明的菌丝，其上产生分生抱子。分生抱子全壁芽殖、单胞、透明、卵形到椭圆形、大小为(2m6m)X(1m3m)，聚集成乳白色粘性抱子滴(参见附录C)。发簇抱Sorothrix:可在大多数培养基上形成。分生抱子梗多侧生，10m30m(50m)，分生抱子(4.5m14m)X (2m3m
12、)，全壁芽生，有0.5mlm的细齿，单胞、透明，椭圆形至长形，尖端通常较细、微弯，连有一个小囊领。菌丝体分生抱子常聚成粘性滴状，酵母状芽殖。3 G/T 28082-2011 酵母状分生抱子Blastomyces:在液体培养基中产生，单胞，酵母状芽殖，抱子大小变化很大。子囊壳在ESA培养基上表生到部分埋生，有褐色假根状菌丝附着在基质上。子囊壳基部球形、黑色，宽75m140m，刚毛稀少至中度，褐色至黑色、有隔130mX3m;子囊壳颈部黑色，长230m640m(l 070m)，颈基部直径19m36m，顶部9m14m;颈长度与基部球宽度之比通常为1.56. 2;孔口缘丝茂盛，透明、有隔、少分枝，(20
13、m60m)X(1m2m);子囊薄壁、球形至卵形、易消解z子囊抱子透明、单胞、桔瓣形，(4.5m6m)X(1m1.5m)，聚生成奶白色粘性抱子滴。自然条件下产生的交配型B占优势，雌性交配型A强烈排斥O.ulmi的雄性交配型B。9. 2 Ophiostoma ulmi 9.2. 1 菌落特征在MEA培养基上经20.C黑暗7d和室温漫射光10d培养后，菌落呈光滑蜡质、苔状，轮纹不明显。乳白至黄褐色，偶有紫褐色斑块，气生菌丝难辨。在20.C时，生长速度为(1.5 mm/d )2. 0 mm/d3. 1 mm/d( 3. 5 mm/d)，在33.C条件下的生长速度较O.no!阶ulmi快，为1.1 mm
14、/d2. 8 mm/d. 9.2.2 病菌形态O. ulmi的3种分生抱子的形态与O.novoulmi基本一致(9.1.2)，唯发簇抱S户。rothrix的菌丝体分生抱子和其出芽形成的分生抱子常合生成酵母状团块。子囊壳在ESA培养基上表生到部分埋生，有褐色假根状菌丝附着在基质上。子囊壳基部球形、黑色，宽100m150m，刚毛稀少至中度，褐色至黑色、有隔130mX3m子囊壳颈部黑色，长280m420m(510m)，颈基部直径为18m42m，顶部11m16m;颈长度与基部球宽度之比通常为2.43. 5;孔口周丝茂盛，透明、有隔、少分枝，(20m60m)X (1 flm2m);子囊博壁、球形至卵形、
15、易消解;子囊抱子透明、单胞、桔瓣形，(4.5m，-_，6m)X(1m1.5m)，聚生成奶白色粘性抱子滴。自然条件下产生的交配型A和B大致相等，雌性交配型A可接受O.novoulmi的雄性交配型B.9. 3 Ophiostoma nov(-ulmi和Ophiostomaulmi的特征比较特征比较见表10表1特征比较特征Ophiostoma novo-ulmi 。hiostomaulmi 20.C (2.8)3. 14.8(5. 7) (1. 5)2. 03.1(3. 5) 生长速度mm/d33.C (O )0. 1 O. 5 1. 12. 8 菌落形态花瓣状、轮纹明显，有条纹光滑蜡质、苔状，轮纹
16、不明显交配型B型占优势A型和B型大致相等颈长230640(1 070) 280420( 510) m 子褒壳颈长与基部球1. 56. 2 2. 43. 5 直径比一4 G/T 28082-20门9.4 结论如分离菌的形态特征与鉴定指标吻合，可鉴定为榆枯萎病菌。否则，不视为榆枯萎病菌。10 样晶保存检疫鉴定后保存样品，以备复验、谈判和仲裁。由鉴定人标识确认、样品管理员登记，置于干燥、防虫、防鼠处保存，保存期为1年，有特殊需求保存期可适当延长。保存期满，需经灭菌后方可处理。11 菌种保藏将病菌接在MEA培养基斜面上，待菌丝布满斜面后，封好盖子，-2(oc保存。5 GB/T 28082-20门附录A
17、(资料性附录)榆枯萎病菌的分类、寄主与分布A.l 分类榆枯萎病是榆树上的毁灭性病害，常年危害欧美的林木业，在20世纪30年代和70年代曾引起两次大规模流行。榆枯萎病的致病菌已经分化为2个种，0hiostomulmi引致欧美的第一次大流行，0hiostoma novo-ulmi是第二次大流行的致病菌，在中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录中称为新榆枯萎病菌。0hiostomanovo-ulmi侵袭性较强，其内分为两个亚种欧亚亚种0hiostoma novo-z山nisubsp. novo-ulmi和美洲亚种0hiostomanovo-ulmi subsp. americanao本标准将0hi
18、ostoma ulmi和Ophiostomanovo-ulmi统称为榆枯萎病菌。A.2 寄主范围寄主主要为榆属(UlmusL.)树木。以美洲榆(U.americana)，荷兰榆(U.hollandica)，山榆(U. glabra) ，英国榆(U.procera)等较为感病，人工接种可为害棒属(ZelkovaS. )。该病菌是欧美榆属上的重要有害真菌，可侵染各龄榆树，引致榆树干枯、死亡，称为榆枯萎病，或荷兰榆病。A.3 分布亚洲:亚美尼亚、阿塞拜噩、格鲁吉亚、伊朗、土耳其、乌兹别克斯坦、哈萨克斯坦(仅Ophiostomanovo-ulmi)。欧洲z阿尔巴尼亚、爱尔兰、丹麦、挪威、瑞典、波兰、捷
19、克、斯洛伐克、匈牙利、法国、德国、奥地利、荷兰、瑞士、英国、比利时、西班牙、葡萄牙、意大利、罗马尼亚、希腊、摩尔多瓦、乌克兰、俄罗斯、圣马力诺、塞尔维亚、波黑(仅Ophiostomanovo-ulmi)、克罗地亚(仅0hiostomanovo-z山川)、斯洛文尼亚(仅0hiostoma novo-ulm i)、保加利亚(仅0户hiostomanovo-ulmi)、马其顿(仅Ophiostomanovo-ulmi)、白俄罗斯(仅Ophiostomaulmi)、芬兰(仅0户hiostomaulmi)。美洲:美国、加拿大。大洋洲:新西兰(仅0hiostomanovo-ulmi)。6 B.1 鉴定附录
20、B(资料性附录)欧亚亚种Ophiostomanovo-ulmi subsp. novo-ulmi和美洲亚种Ophiostoma novo-ulmi subsp. americana的鉴定方法B. 1. 1 交配型的测定GB/T 28082-20门亚种的鉴定首先要确定供试菌的交配型。取标准菌株0hiostomanovo-ulmi任意亚种的交配型A和B以及待测菌，等距离三角形分别接种在ESA培养基上，重复3皿，20.C黑暗培养1周后，在室温(20 .C 25 .C)漫射光下继续培养两周。B. 1.2 A交配型的培养经测定交配型为A的供试菌，在MEA培养基上20.C黑暗培养;取标准菌株美洲亚种的B交
21、配型为受体，接种于ESA培养基，20.C黑暗培养14d，再漫射光下继续培养7d，使菌落长满全皿;切取MEA培养基上的待测菌2cm2为供体，菌面朝下贴放在受体菌落的一侧，另以标准菌株荣洲亚种和欧亚亚种的A交配型为供体对照，同法分别置于受体的另外部位，重复3皿，室温漫射光下培养。10d后记录各供体上每1cm2的子囊壳数目。B. 1. 3 B交配型的培养经测定交配型为B的供试菌，在MEA培养基上20.C黑暗培养;取标准菌株欧亚亚种的A交配型为受体，接种于ESA培养基，20.C黑暗培养14d，再漫射光下继续培养7d，使菌落长满全皿;切取MEA培养基上的待测菌Zcm2为供体，菌面朝下贴放在受体菌落的一侧
22、，另以标准菌株美洲亚种和欧亚亚种的B交配型为供体对照，同法分别置于受体的另外部位，重复3皿，室温漫射光下培养。10d后记录各供体上每1c旷的子去完数目。B.2 结果判定B.2.1 交配型判定若待测菌与交配型B的交界处产生子囊壳，则待测菌为A交配型;若待测菌与交配型A的交界处产生子囊壳，则待测菌为B交配型。B.2.2 A交配型亚种判定若待测菌与受体(美洲亚种B交配型)所生子囊壳数目与供体对照美洲亚种A交配型所生子囊壳数目大致相等，是供体对照欧亚亚种A交配型所生子囊壳数目的10倍30倍，则待测菌为美洲亚种。若待测菌与受体(美洲亚种B交配型)所生子囊壳数目与供体对照欧亚亚种A交配型所生子囊壳数目大致
23、相等，是供体对照美洲亚种A交配型所生子囊壳数目的1/101/30，则待测菌为欧亚亚种。B.2.3 B交配型亚种判定若待测菌与受体(欧亚亚种A交配型所生子囊壳数目与供体对照欧亚亚种B交配型所生子囊7 GB/T 28082-20门壳数目大致相等，是供体对照美洲亚种B交配型所生子囊壳数目的10倍30倍，则待测菌为欧亚亚种。若待测菌与受体(欧亚亚种A交配型所生子囊壳数目与供体对照美洲亚种B交配型所生子囊壳数目大致相等，是供体对照欧亚亚种B交配型所生子囊壳数目的1/101/30，则待测菌为美洲亚种。8 GB/T 28082-2011 附录C(资料性附录)揄枯萎病菌形态示意图图C.1子囊壳(左)和粘束梗霉
24、Pesotumulmi (右)(仿F.W. Holmes) 图C.2发簇抱Sporothrix(左)酵母状西子Blastomyces(右)(仿F.W. Holmes) 9 ONlNONH阁。国华人民共和国家标准榆枯萎病菌检疫鉴定方法GB/T 28082-2011 中铃中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销9导开本880X12301/16 印张1字数17千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷祷18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107书号:155066 144638定价GB/T 28082-2011 打印H其I:2012年4Jj27忖F002A
