1、ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 28084-2011 棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定Detection and identification of Verticillium dahliae Kleb. 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准棉花黄萎病菌检瘟检测与鉴定GB/T 28084-2011 晤中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号。00045)网址总编室:(010)64275323发行中心
2、:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销铸开本880X 1230 1/16 印张0.75字数17千字2012年5月第一版2012年5月第一次印刷晤t号:155066. 1-44639定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28084-2011 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、河南省植保植检站、四川省植物检疫站。本标准主要起
3、草人:吴立峰、韩世平、宁红、白小东、刘辉志、李素芳、熊红利、张磊。I GB/T 28084-20门棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定1 范围本标准规定了棉花黄萎病田间症状识别、抽样，棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae Kleb. )的分离培养、检测鉴定等方法。本标准适用于棉花植物组织和棉籽中棉花黄萎病菌的检疫检测和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 15569 农业植物调运检疫规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 微菌
4、核microscler吼ium棉花黄萎病菌生长过程中，由一条或数条分隔菌丝体膨大、胞壁增厚，并向各个方向芽殖形成的肉眼可见的黑色菌丝颗粒。3.2 选择性培养基selective medium 进行植物病原菌分离培养时，为促进目标菌落的形成，抑制其他非目标菌的生长，在培养基中添加不同的碳源、氮源或抑制性物质而形成的具有一定选择能力的培养基。4 原理棉花黄萎病菌主要存在于棉花植株、棉籽、土壤、病残组织、粪肥等处，侵染棉花植株后所表现的典型症状是田间诊断的重要依据;利用选择性培养基，从不同的带菌材料中分离出目标病原菌，进行形态特祉鉴定。5 仪器、用具及试剂5. 1 仪器、用具天平、高压灭菌锅、培养箱
5、、生物显微镜、移液器、慑子、解剖刀、接种棒、9cm12 cm培养皿、烧杯、载玻片、盖玻片、吸管、超净工作台等。5.2 试剂除非另有说明，本标准仅使用分析纯试剂。1 GB/T 28084-2011 5.2. 1 磷酸氢二饵(K2HP04)。5.2.2 氯化饵(KCD。5.2.3 硫酸镜(MgS04)。5.2.4 L-天门冬酷胶(C4HsN203H20)。5.2.5 乙二股四乙酸铁铀CH2N(CH2COO)2J2FeNa。5.2.6 L-山梨糖(C6H12 06)。5.2.7 琼脂。5.2.8 75%五氯硝基苯(C6C15N02)。5.2.9 牛胆盐。5.2. 10 四珊酸铀(Na2B407.10
6、H20)。5.2. 11 硫酸链霉素(C21H41 N7 016白。5.2. 12 葡萄糖(C6H12 06 820)。5.2.13 0.1%升录。5.2. 14 70%乙醇。5.2. 15 马铃薯。5.2. 16 灭菌水。6 症状识别在棉花黄萎病显症明显的花铃期和吐絮期进行2次3次调查。每次调查时，首先目视全田，若观察不到可疑病株，则进行踏查，方法是每隔两行顺垄检查有无可疑病株。对检查到的可疑病株，参照附录A进行识别判断，确认是否是棉花黄萎病，并采集、保存病株标本，记录调查结果。现场不能确认的，整株取样带回实验室鉴定，填写附录B(有害生物调查抽样记录表。7 病原鉴定7. 1 抽样7. 1.
7、1 棉籽抽样需要进行室内棉花黄萎病菌检测的棉籽，按照GB15569的有关要求进行抽样，填写附录B(有害生物调查抽样记录表)，送实验室检验鉴定。7. 1.2 受害植株抽样在棉花生长期间，特别是棉花黄萎病发病高峰期，加强田间观察，发现有棉花黄萎病疑似症状的植株，整株取样送实验室检测。填写附录B(有害生物调查抽样记录表。7.2 分离和培养7.2. 1 制样7.2. 1. 1 棉籽将送检的每个棉籽样品分为2份，一份保存备查，一份用于检验，每份样品不少于50go 7.2. 1. 2 植物组织选取有疑似症状的植株材料:叶片材料取病健交界处组织，每个约0.5cm2;茎杆、叶柄材料直接切2 取维管束变色部分组
8、织，每个长约0.5Cffi D 7.2.2 消毒与培养7.2.2.1 棉籽G/T 28084-2011 将棉籽放入70%乙醇中浸泡2s3 s，除去气泡，置于0.1%升柔液中消毒2min，用灭菌水冲洗2次3次。然后用灭菌慑子将其移放到Christen选择性培养基平板上，每个平板放置5粒，每个样品设3个重复，置于24C25 DC的培养箱内3d4 d，然后放入冰箱冷处理(0DC5 c , 24 h)，再放回原培养箱内黑暗培养10d。Christen选择性培养基配方及制作方法参见附录C。7.2.2.2 植物组织将取得的植物组织置于0.1%升录液中表面消毒1min，用灭菌水冲洗2次3次，然后置于Chri
9、steh选择性培养基平板上，每个平板放置3个5个，每个样品设3个重复。置于24DC25 DC培养箱内黑暗培养10d。7.2.3 分离纯化检查培养10d后的平板，若出现乳白色菌藩，将其转接至PDA培养基上，并在24C25 DC黑暗培养10d。PDA培养基配方及制作方法参见附录C。7.2.4 形态鉴定观察微菌核的形成情况，并挑取PDA平极上的培养物进行显微镜检查，参照附录D描述的病原菌形态特征进行鉴定。7.3 结果判定转接至PDA平板上的培养物培养10d后，在显微镜下观察其形态特征，符合附录D描述的形态特征的，确定为棉花黄萎病菌Verticilliumdahliae Kleb. D鉴定结果填入有害
10、生物样本鉴定报告)(参见附录E)。8 标本及资料保存检测鉴定完成后，样品和分离物需作为标本保存的，制成标本并妥善保存1年。其余用于检测的样品应集中销毁，用具应进行灭活处理。检测鉴定过程及有关数据、表格要进行详细记录并归档保存。3 GB/T 28084-20门附录A(资料性附录)棉花黄萎病菌的分类地位及危害症状A.l 分类地位棉花黄萎病菌CVerticilliumdahliae Kleb. )属半知菌亚门CDeuteromycotina)、丝砸纲CHyphomycetes)、丛梗抱目CMoniliales)、丛梗抱科CMoniliaceae)、轮枝菌属CVerticillium)。A.2 危害症
11、状A.2.1 幼苗期症状一般在3片5片真叶期显示症状，病株比正常植株略矮，叶片上出现斑驳，剖开维管束有淡褐色病变。A.2.2 成株期症状棉花黄萎病大多在现蕾后开始发病，开花结铃期达到发病高峰。病株一般从下部开始发病，逐渐向上发展，病叶边缘和叶脉之间叶肉部分出现淡黄色斑驳，形状不规则，逐渐扩大成明显的黄色斑驳，随后斑驳变褐，发病严重时，除主脉及主脉附近仍为绿色外，其余部分均变为黄褐色，病叶呈掌状斑驳，俗称西瓜皮;有时病斑变褐、焦枯、脱落，只残留叶脉，呈鸡爪状。夏季低温多雨或大水漫灌后，植株可出现急性萎焉症状，叶片先从上部开始突然萎焉下垂，水烫状，叶色暗淡，严重时叶片脱落形成光杆。用解剖刀横切或纵
12、切病株茎杆和叶柄，可见维管束变褐。4 GB/T 28084-2011 附录B(资料性附录)有害生物调查抽样记录表表B.l有害生物调查抽样记录表编号z生产/经营者地址及邮编联系/负责人联系电话调查日期抽样地点样品植物名称(中文名和学名)品种名称植物生育期调查代表植物来源编号株数或面积症状描述:发生与防控情况及原因:抽样方法、部位和抽样比例z备注:抽样单位(盖章): 生产/经营者:填表人(签名): 现场负责人2年月日年月日注:本单一式两份，分别由抽样单位和受检单位保存。5 GB/T 28084-20门附录C(资料性附录)培养基配方及制作方法c. 1 Christen选择性培养基配方及制作方法C.
13、1. 1 配方磷酸氢二饵1g，氯化伺0.5g，硫酸镜0.5g，乙二股四乙酸铁铀0.01g，L-天门冬酷腊2g，L-山梨糖2 g，琼脂20g，蒸锢水1000mL, 75%五氯硝基苯1g，牛胆盐0.5g，四棚酸铀1g，硫酸链霉素0.3g。C. 1.2 制作方法琼脂20g加入蒸馆水1000mL，加热溶化后，加入磷酸氢二何1g，氯化饵0.5g，硫酸镜0.5g，乙二胶四乙酸铁铀O.Olg，L-天门冬酷胶2g，L-山梨糖2g，充分混和溶解。用磷酸将pH值调至5.4，分装，120 oC 125 .C高压灭菌30min，温度降至50.C(不烫手)时，在灭菌条件下加入75%五氯硝基苯19、牛胆盐0.5g，四珊酸
14、铀1g，硫酸链霉素0.3g，混和均匀。C.2 PDA培养基配方及制作方法C. 2.1 配方马铃薯200g，葡萄糖15g20 g，琼脂17g20 g，水1000mL。C.2.2 制作方法将洗净去皮的马铃薯切碎，加水1000mL煮沸1h，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000mL;加入葡萄糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化后，分装，120.C125.C高压灭菌30min 6 GB/T 28084-20门附录D(资料性附录)棉花黄萎病菌在PDA培养基上的形态特征D.l 棉花黄萎病菌形态特征菌落呈绒毛状，初生菌丝体无色，生长时间较长的菌丝变成灰白色，有隔膜。培养10d以上的菌落可在培养基上长出大量黑褐色微菌核，
15、长形至不规则球形，直径15m50mo分生子包子梗由2轮4轮层辐射状的枝梗及上部的顶枝构成，每轮层有枝梗1枝7枝，分枝大小为(13.7m21.4m)X (1. 5m2. 7m)，基部略膨大，始终透明。小枝顶端的产抱瓶体连续产生分生抱子，分生抱子元色，单抱，椭圆形、近圆筒形，大小为(1.9m3. 57m) X (2.5m7. 38m)。D.2 棉花黄萎病菌与黑白轮枝菌形态特征比较棉花黄萎病菌与黑白轮枝菌Verticilliumalbo-atrum Reinke &. Berthiner为同属土传病原真菌，两种病原菌形态特征主要区别见表D.1。表D.l棉花黄萎病菌与黑白轮桂菌形态特征比较病原菌菌落形
16、态分生抱子梗休E民结构pH3.6条件下30.C条件下生长状况生长状况棉花黄萎病菌绒毛状，圆形，较短，基部透明微菌核，黑褐色生长良好生长良好白色黑白轮校菌绒毛状，圆形，较粗壮，基部黑褐色厚壁休生长不良不能生长白色至黑褐色暗色、膨大H民菌丝结-FON|寸ONH阁。GB/T 28084一2011附录(资料性附录)有害生物样本鉴定报告E 有害生物样本鉴定报告植物名称品种名称植物生育期样品数量取样部位样品来源送检日期送检人送检单位联系电话检测鉴定方法z检测鉴定结果z备注:鉴定人(签名): 审核人(签名): 鉴定单位盖章:年月日注:本单一式三份，分别由抽样单位、受检单位和鉴定单位保存。表E.1侵权必究nu nu nhu A哇AUZ-唱aA- nhu cu nu -HJV phd 唔EA-. . 号一价书一定* 版权专有16.00 立已GB/T 28084-2011 打印H期:2012年5月22日F002
