1、ICS 65.020.01 B 16 道B中华人民共和国国家标准GB/T 28089-2011 葱类黑粉病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Urocystis cepulae Frost 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准葱类黑粉病菌检瘟鉴定方法GB/T 28089-2011 * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(01
2、0)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销争6开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数17千字2012年3月第一版2012年3月第一次印刷* 书号:155066. -44643定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28089-2011 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人
3、民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人z邵秀玲、赵汗青、王英超、种巍、吴兴海、张治宇、江丽辉、高文娜、张京置、宋涛、罗志萍。I GB/T 28089-2011 葱类黑粉病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了葱类黑粉病菌检疫鉴定方法。本标准适用于洋葱等葱属中葱类黑粉病菌的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 18085 植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程SN/T 1809 进出口植物种子检
4、疫规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 抱子球spore balls 由一至多数冬抱子集结而成，易分开成单独的冬抱子或坚固而不易分离，外层有浅色的较小的不孕细胞包围。4 葱类黑粉病菌基本信息中文名z葱类黑粉病菌。学名:Urocystiscepulae Frost 1877 异名:Tuburcinia cepulae (Frost) Liro 1922 , Tuburcinia magica (Pass. ) Liro 1922 , Urocystis colchici var. ceulae Cooke 1877 ,Urocystis magica Pass. 18750 病
5、害英文名:onionsmut。属真菌界Fungi，担子菌亚门Basidiomycotina，黑粉菌纲Ustilaginomycetes，条黑粉菌目Urocystales，条展粉国科Urocystaceae，条黑粉菌属Urocystis。葱类黑粉病菌的其他信息参见附录A。5 方法原理经现场查验，实验室分离培养，根据病原菌的形态特征、生物学特性，结合寄主范围进行结果判定。6 仪器和用具6. 1 生物显微镜(具油镜镜头，具测量功能)、具透射光源的体视显微镜(放大倍数不低于50X)。GB/T 28089-2011 6.2 超净工作台。6.3 电子天平。6.4 光照恒温培养箱。6.5 酒精灯。6.6 高
6、压灭菌器。6. 7 培养皿。6.8 医用手术剪、慑子。6.9 烧杯(500mL)。6. 10 试管(直径12mm)。6. 11 载玻片、盖玻片。6.12 量筒(500mL)。6. 13 微量可调加样器(5L20L)。6. 14 刻度离心管:10mL或20mL。6.15 加样器枪头(2L20L)。6.16 三角瓶(250mL)。6.17 席尔氏浮载剂(见GB/T1&08日。6. 18 干热灭菌器。6.19 往复式振荡器。6.20 涡旋振荡器。7 主要试剂7. 1 蒸馆水。7.2 吐温-20。7.3 1%的次氯酸铀溶液。7.4 洋葱琼脂培养基。8 现场检测8. 1 抽样方法棋盘式、五点式或随机抽样
7、。8.2 抽样数量8.2. 1 种子对来自葱类黑粉病菌发生国家和地区(参见附录A)的洋葱等种子按SN/T1809进行抽样。8.2.2 洋葱、大蒜等鳞茎对洋葱、大蒜等鳞茎按SN/T1157进行抽样。8.3 症状检查对洋葱、大蒜等鳞茎，注意检查鳞茎上是否有典型的黑粉症状，挑选个头小(抱子在鳞茎上产生可能引起鳞茎变小、干腐的鳞茎，洋葱鳞茎常形成铅色到黑色的条斑;洋葱叶片上形成铅色到黑色的轻微变GB/T 28089-2011 厚的条斑或水泡，当增厚区域较大时可引起子叶向下弯曲。随着叶片基部病斑的扩大，病斑破裂漏出大量的黑色粉末。受侵染的植株通常变得矮小。收集上述可疑植物材料等一并带回实验室检验。9 实
8、验室检测9. 1 鳞茎和寄主残体上病菌的鉴定选取具有黑粉症状的可疑病斑，用针刺破囊肿，用席尔氏浮载剂制成玻片，在显微镜下观察抱子球的形态特征。9.2 种子上病菌的鉴定9.2. 1 制备平均样晶在实验室内将送检样品充分混匀，制成平均样品。9.2.2 称样从平均样品中称取50g作为实验样品。9.2.3 洗海离心实验样品倒入经干热灭菌(165oC ,1. 5 h)后的250mL三角瓶内，加蒸锢水100mL，再加表面活4性剂吐温-20(1滴-2滴)，用铝铀纸或parafilm膜将三角瓶封口。将三角瓶放在复式振荡器上振荡5 min，立即取下三角瓶，将悬浮液注入干热灭菌的10mL20 mL刻度离心管内离心
9、(1000 r/ min) 3 mino取出离心管，倾去上清液，再加剩余悬浮液，重复离心，直至所有悬浮液离心完毕，留沉淀物。9.2.4 制片与镜检离心管中，加入适量席尔氏浮载剂使之悬浮。用可调微量加样器吸取5L20L冬抱子悬浮液至载玻片上，加盖玻片。制片用冬抱子悬浮液的体积以加盖玻片后悬浮液不外溢为宜。每份试验样品的冬抱子悬浮液至少镜检5张玻片，每片按视野依次全部检查。观察冬袍子特点，注意观察冬抱子壁的厚薄，颜色等特征。9.2.5 抱子球的萌发试验在离心管中加入适量1%的次氯酸铀潜液，将9.2.3所获得的沉淀物涂于载玻片上，在体视显微镜下挑取一定数量的冬抱子球放人，用涡旋振荡器混合，消毒5mi
10、n后，以3000r/min离心1min，立即用微量加样器吸去上清液，加元菌水离心清洗2次，将冬抱子球沉淀物转至洋葱琼脂培养基(参见附录B)上培养，条件为13oC22 oC、12h间隙光照、75%的空气湿度，重复3个培养皿。10 鉴定特征10. 1 寄主植物症状洋葱、大蒜等鳞茎表面有铅色泡状囊肿，囊肿刺破后有典型的黑粉症状，鳞茎个头小、干腐，发病较轻的洋葱鳞茎常形成铅色到黑色的瘤肿条斑。洋葱叶片上形成铅色到黑色的有轻微变厚的条斑或水泡，当增厚区域较大时可引起子叶向下弯曲。随着叶片基部病斑的扩大，病斑破裂漏出大量的黑色粉末。重病植株通常变得矮小，易死亡。3 GB/T 28089-2011 10.2
11、 西子球特征冬抱子生在寄主体内，成熟时破裂组织后露出粉状抱子团，黑褐色的粉末状是抱子球。抱子球由一个冬抱子组成，甚少2个，抱子球球形或椭圆形，直径14m25m，黑褐色，每个单抱的冬抱子周围由一层直径4m8m的细长的不育细胞包围(参见附录C)。冬抱子球形或广椭圆形，直径10m16m，赤褐色，壁光滑。不育细胞元色至淡黄色，半透明的球形，12个15个，形状和大小一致。10.3 抱子球萌发生理特性抱子球在洋葱琼脂培养基上培养2d3 d后进行观察(参见附录。，冬抱子伸出短而半圆形、元色的先菌丝，先菌丝长到40m50m就停止生长，萌发过程中不产生担抱子，但先菌丝能发生分支，分支菌丝长到15m左右就停止生长
12、，分支菌丝不发生融合而产生分隔的菌丝，菌丝上直接形成抱子球，将萌发后的菌丝转接到洋葱琼脂斜面上保存。10.4 葱类黑粉病菌与其他近似种的主要区别葱类黑粉病菌与其他近似种Urocystiscolchici的主要区别参见附录D。11 结果判定如寄主植物上具有10.1的症状特征，且黑色分离物具有10.2抱子球特征，鉴定为葱类黑粉病菌。从种子分离抱子球的特征与10.2、10.3的鉴定特征相吻合，鉴定为葱类黑粉病菌。12 菌种的保存将鉴定为葱类黑粉病菌的冬抱子真空保存，经登记和经手人签字后置于4.C左右冰箱中保存，至少需保存6个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后，需经灭菌处理。4 GB/T 28089
13、-2011 附录A(资料性附录)葱类黑粉病菌相关资料A.1 分布非洲z埃及、摩洛哥、加莲。亚洲z伊拉克、日本、朝鲜、菲律宾、泰国、印度、伊朗、尼泊尔、中国。欧洲z奥地利、比利时、英国、保加利亚、捷克、丹麦、法国、德国、希腊、意大利、马耳他、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、瑞典、瑞士、匈牙利、芬兰。大洋洲z澳大利亚、新西兰。美洲z加拿大、墨西哥、美国、古巴、波多黎各、智利、秘鲁。A.2 寄主范围葱属，包括洋葱(Alliumcepa)、大蒜(Alliumorrum)、韭葱(Alliumsativum)、鸦蒜(Alliumvineale)等，野生寄主金鱼草属(Antirrhinum)。A.3 传播方式该
14、病菌以菌丝和冬抱子的形式在土壤中生存。冬抱子在土壤中存活时间长(20年以上)，可通过蒙古附在根部表面的土壤、鳞茎的茎基部或鳞茎表面携带的土壤或其他携带土壤的方式作长距离传播，也能够通过侵染的鳞球茎和植物残体，带菌的运输工具和农具传播。短距离主要靠表面的灌溉水，风吹土壤，以及人类、野生动物和鸟类的方式传播。冬抱子能够在洋葱种子中发现，但目前还不能确定该病害是否能够通过种子传播。5 GB/T 28089-2011 附录B(资料性附录)洋葱琼脂培养基的制备B.1 洋葱汁液配方500 g健康洋葱，加水500mL煮沸30min后补足水，取滤液。B.2 洋葱汁液配制方法称取琼脂粉15g20 g，加入100
15、mL经消毒的洋葱汁液，加水补足1000mL。装入三角瓶中，121 .C高压灭菌30min，待冷却至40.C左右，倒入培养皿，凝固后，用三角推蘸取悬浮液均匀涂布在培养基表面。6 G/T 28089-20门附录C(资料性附录)葱类黑粉病菌冬于包子球萌发形态及其发病症状特征图, 图C.l葱类黑粉病菌冬于包子球及其萌发形态特征(引自LenoreGray) FFON|goNH阁。GB/T 28089-2011 附录(资料性附录)葱类黑粉搞菌与近似种的主要区别D 葱类黑珊病菌与近似种的主要区别病害Urocystis ce扣daeUrocystis colchici 寄主Allium spp. Allium
16、 spp.、Colchicumspp.、Bulbocodiumvernum、Camassiaquamash、Camassiascilloides、Muscari sp.、Narcissussp.、Ornithogalumum-bellatum、Polygonatumcommutatum、Polygo-natum odoratum. 抱子球由一个冬抱子和12个15个不育细胞组由2个4个冬抱子和6个或9个不育细胞成，抱子球直径14m25m。冬抱子直径组成，抱子球直径17m40m.冬抱子直径10m16m;不育细胞形状和大小一致12m24m;不育细胞形状和大小不一致表D.1侵权必究书号:155066 1-44643 定价:* 版权专有16.00 :7 GB/T 28089-2011 打印日期:2012年4月16HF002A
