1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民11: _，、gB 和国国家标准GB/T 28099-2011 水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法Detection and identification of Xanthomonas oryzae pV. oryzicolaCFang et al. ) Swings et al. 2011-12-30发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2012-06-01实施发布G/T 28099-2011 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并
2、归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、南京农业大学。本标准主要起草人:易建平、林石明、周国梁、粟寒、印丽萍、孔德英、许志刚、胡白石。I GB/T 28099-20门水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法1 范围本标准规定了水稻细菌性条斑病菌的检测和鉴定方法。本标准适用于水稻种子及植株上水稻细菌性条斑病菌的检测与鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)
3、适用于本文件。SN/T 0800.1 进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 水稻细菌性条斑病菌基本信息中文名:水稻细菌性条斑病菌(稻黄单胞菌稻生致病变种)。学名:Xanthomonasoryzae pV. oryzicolaCFang et a1. , 1956)Swings et a1. ，1990，简称XOCo异名:Xanthomonas campestris pV. oryzicola CFang et a1., 1956) Dye 1978; Xanthomonas oryzicola CFang et a1. , 1956) Dowso
4、n 1943; Xanthomonas translucens f. sp. oryzicola C Fang et a1. , 1956)Bradbury 1971。病害英文名:bacterial leaf streak of rice o 属细菌界Bacteria，变形细菌门Proteobacteria，沪变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xan thomonodales，黄单胞菌科Xanthomonodaceae，黄单胞菌属XanthomonasCDowson，1939)。病菌主要在病种子和病草上越冬，其次在水稻再生苗或李氏禾等杂草上越冬。病菌主要借雨水、流水等
5、传播，带菌种子是远距离传播的主要途径之一。水稻细菌性条斑病菌的其他信息参见附录A。4 方法原理根据症状特征、菌落形态特征、生理生化特征、PCR反应和致病性测试结果等进行检测鉴定。5 主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。三短甲基胶基甲皖盐酸盐CTris-HCl)、乙二胶四乙酸CEDTA)、十二皖基硫酸铀CSDS)、十六烧基三甲基漠化腊CCTAB)、三氯甲皖、异戊醇、乙醇、蛋白酶、漠化乙镜、酵母粉、琼脂、蛋白陈、牛肉浸膏、营养肉汤、葡萄糖、蔚糖、谷氨酸铀。培养基和试剂配方见附录B。1 GB/T 28099-2011 6 仪器用具超净工作台、高压灭菌锅、生物显微镜、培养箱、电子天平、
6、冰箱、离心机、水浴锅、培养皿、三角瓶、剪刀、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统、微量可调加样器和离心管。7 检测与鉴定7. 1 现场检瘟按照SN/T2122和SN/T0800.1规定的程序进行现场检疫并抽取样品。7.2 实验室检测7.2.1 有症叶片的分离有症叶片用元菌水冲洗后取病斑前沿2mm7mm部分用70%酒精表面消毒15s，无菌水洗三次后用无菌剪刀剪碎，置于元菌载玻片上，加一滴元菌水，不加盖玻片，置于显微镜下观察喷菌现象，如观察到喷菌现象，从喷菌处用接种环取一环处理撒在NACPSA或NBY)培养基平板上划线分离，重复3个平板，27.C培养3d5 d。7.2.2 无
7、症叶片的分离取10张无症叶片，剪碎研磨后提取DNA，进行PCR检测，DNA提取程序和PCR检测程序见附录C。阳性样品进行病菌分离。另取元症叶片10张，元菌水冲洗叶面，70%酒精表面悄毒15s，无菌水洗三次后用元菌剪刀剪碎，加入适量元菌水，静置15min，用接种环取处理液在NA(PSA或NBY)培养基平板上划线分离，重复3个平板，27.C培养3d5 do 7.2.3 从种子中分离种子处理液在培养基上富集后进行PCR检测，100g种子磨碎后置于200mL含有0.01%Tween 20的无菌水中4.C过夜，取100L处理液在PSA培养基平板上涂布，重复3个平板，27.C培养2 d，每个平板用1mL元
8、菌水洗下，取洗板液用于PCR检测，阳睦样品进行病菌分离。取种子处理液1 mL在无菌水中系列稀释三次，分别取稀释和未稀释的处理液100L在NACPSA或NBY)培养基平板上划线分离，重复3个平板，27.C培养3d5 d. 7.3 鉴定方法7.3. 1 形态特征鉴定NA培养基上菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整;初始为白色，后变为浅黄色;NBY培养基上的菌落浅黄色，圆形，凸起，粘液状;PSA培养基上菌落浅黄色，粘液状，有光泽。挑取可疑菌落在NA培养基平板上纯化三次后进行鉴定。7.3.2 生理生化鉴定病菌能使明胶液化，使石藤牛乳腺化，使阿拉伯糖产酸;不还原硝酸盐，产生氨和硫化氢;不产生呵
9、|睐;可分解煎糖、葡萄糖、果糖、木糖和乳糖等产生酸，但不产生气体;对青霉素、葡萄糖反应钝感。也可用BIOLOG微生物自动鉴定系统进行鉴定。GB/T 28099-20门7.3.3 PCR方法鉴定制备分离物108CFU/rnL细菌悬浮液，1rnL菌悬液提取DNA后进行PCR检测，检测程序见附录Co7.4 致病性测试三种鉴定方法之一为阳性的分离物进行致病性测试。30d45 d龄期大小的IR24或汕优63种植在12h光照/黑暗的循环条件下，最适温度为28oC 32 oC/22 oC (白天/夜晚)。用无菌生理盐水配制108CFU/rnL细菌悬浮液，元菌接种针蘸取菌液后针刺接种于叶片中部，每张叶片针刺两
10、个点，共接种30张40张叶片。接种植株用塑料袋保湿24h , 12 h光照/黑暗的循环条件下30.C培养，接种48h 72 h后观察症状，最长至14d。初始症状为接种点出现红色条斑，通常10d后显症，病斑边缘为线条形，沿叶脉扩展。如果产生典型症状，从接种病斑上再次分离病菌，培养基上形态特征相符或PCR检测为阳性即可认为接种分离物为水稻细菌性条斑病菌。8 结果判定从样品中分离得到的可疑分离物用形态特征，生理生化或PCR检测等三种方法之一进行鉴定;阳性分离物进行致病性测试，出现典型症状，判定为检测出XOC;其余情况判定为未检出XOCo9 样晶保存阳性种子样品至少保存6个月，至少1000粒，以备复核
11、、谈判和仲裁;阳性的植物材料及时销毁处理;分离菌株应妥善保存，将菌株转接到NA试管斜面上，28c培养48ho然后置于4.C冰箱中保存，定期(30d)转接;或在菌悬液中加入15%30%甘油于一80C下保存;必要时可将菌株冻干，-80.C下长期保存。3 GB/T 28099-2011 附录A(资料性附录)水稻细菌性条斑病菌其他信息A.1 检瘟重要性中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录)(2007年)中的检疫性有害生物之一，目前国内受害病区已超过11个省。欧洲和地中海国家植物保护组织(EPPO)的Al类检疫性有害生物。目前分布于热带亚洲地区、西非和澳大利亚等地。A.2 寄主植物主要寄主是水稻Or
12、yzasativa ;其他寄主包括:稻属Oryzaspp. ，李氏禾属Leersiaspp. ，丝千金子Leptochloa filiform is ，圆果雀碑Paslumorbiculare ，菱白Zizaniaaquatica ，沼生蔬Z.alustris和结缕草Zoysiajaponica。A.3 形态特征病菌为革兰氏染色阴性，短杆状，大小(0.4m0.6m)X(l.lm2.0m);元芽抱和英膜，菌体外具粘质的胞外多糖包围;单生，很少成对，不呈链状;极生鞭毛一根。最适生长温度25.C28 .C , 生长温限8.C38.C。A.4 症状特征整个水稻生育期的叶片均可受害。病菌进入气孔在叶片薄
13、壁组织内繁殖，主要感染叶片薄璧组织细胞，局部侵染。病斑初呈暗绿色水渍状半透明的小点，渐形成叶脉间透明条斑，限在叶脉之间延伸，颜色由黄褐转橙褐色，这种透明条斑与白叶枯病的不透明症状差异明显。病斑上常泌出许多露珠状的蜜黄色菌服(参见图A.l)。病情严重时，许多条斑融合、连接在一起，成为不规则的黄褐色至枯黄色斑块，此时病叶枯萎，变褐，最后死亡，后期的症状与白叶枯病有些相似(参见图A.2)。4 GB/T 28099-2011 图A.1叶片症状图A.2田间症状5 GB/T 28099-20门B.1 NA培养基附录B(规范性附录)培养基和试剂配方蛋白陈5g，牛肉浸膏3g，琼脂18g，加蒸锢水至1000mL
14、, pH 6. 87. 0 , 121 .C湿热灭菌15min. B.2 NBY(Nutrient Broth Yeast Extract Agar Medium)培养基Sol. 1:营养肉汤8g;酵母粉2g;K2HP04 2 g;KH2P04 0.5 g;琼脂18g;蒸锢水950mL Sol. 2:葡萄糖5.0g溶解于蒸锢水50.0mL中。Sol. 3 : 1 mol/L的MgS04 7H20 1 mL(2. 46 g MgS04 7H20溶解于10mL蒸锢水)。三种溶液单独121.C湿热灭菌15min，待温度降到45.C50.C时混匀后倒制平板。B.3 PSA培养基庶糖10g，蛋白陈10g
15、，谷氨酸铀1g，琼脂17g，加蒸馆水至1000mL，调节pH至6.87.0，加热溶解后121.C湿热灭菌15min B.4 TE-缓冲灌用1mol/L Tris-HCl,pH 8和O.5 mol/L EDT A母液配制，1mol/L Tris-HCl, 10 mL;O. 5 mol/L EDTA, 2 mL;加水至1000mL。B.5 10% SDS(十二镜基暗酸铀)10 g溶于100mL水。B.6 CTAB(十六娱基三甲基滇化服)10 g CTAB溶于100mL O. 7 mol/L NaCl 溶液中(0.7mol/L NaCl:4. 1 g NaCl 溶于10mL水)。B.7 5XTAE缓
16、冲灌54 g Tris;27. 5 g棚酸;0.5mol/L EDTA, pH 8, 20 mL;加水至1L。配制琼脂糖凝胶用0.5X TAE缓冲液。6 C.1 DNA提取程序附录C(规范性附录)PCR检测方法GB/T 28099-2011 叶片样品组织3g5 g在研钵中研磨后取0.1g转入1.5 mL离心管，提取DNA;从种子或叶片上分离的菌株，NB培养基中300C振荡培养过夜，取1.5 mL转入离心管，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀提取DNA;组织浸出液12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀提取DNAoDNA提取步骤:加入500LTE缓冲液悬浮沉淀，加入10
17、%SDS 75L和10mg/mL的蛋白酶10L，370C轻轻振荡孵育1h;加入5mol/L NaCl 120L，上下颠倒几次充分混匀，加入CTAB(10%CTAB溶于O.7 mol/L NaCl溶液中)100L;充分混匀后650C孵育20min;加入等体积(约700L)的三氯甲皖:异戊醇(24: 1)，振荡混匀30min;室温下15000r/min离心30min，取上层水相转入离心管;11D入等体积的异丙醇，室温下15000r/min离心30min，弃上清液，沉淀转人750L70%乙醇中(乙醇洗前可以放入冰箱中过夜);14000 r/min离心8min，沉淀在空气中干燥后洛于50LTE中(可7
18、00C孵育加快溶解), 4 oC冰箱中保存备用。商用kit也可用于样品DNA的提取。C.2 引物上游引物XoocF:5-atattgggctggtgggtga-3;下游引物XoocR:5-ttggtacgcgatgccctttgcgacgg-3;扩增产物为338bp。C.3 PCR反应体系PCR反应体系(50L):10XPCR缓冲液，2.5mmol/L的MgClz,0. 2 mmol/L的各种dNTP混合物，2U的TaqDNA聚合酶，25pmol/L的每对引物各1.0L，2L的细菌悬浮液或DNA模板。C.4 PCR反应条件940C 5min;940C 30s, 620C 30s, 720C 1
19、min，35个循环;720C10 mino C.5 电泳分析取10L扩增产物与3L的6X上样缓冲液混合均匀，在0.5XTAE缓冲液配制的1.5%琼脂糖凝肢中，4V /cm6 V /cm电泳30min，澳化乙链(EB)染色后在成像系统中观察，拍照并保存。C.6 PCR结果判定阴阳性对照正常的情况下，如果扩增出338bp的特异性条带表明样品中存在Xoc。工ON|白白。NH白。华人民共和国家标准水稻细菌性条斑病菌的检瘟鉴定方法GB/T 28099-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数15千字2012年5月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2012年5月第一版* 书号:155066. 1-44653 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28099-2011 打印忖期:2012年5月22H F002
