1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准GB/T 5009.118 2003 代替GB!T14933 1994 小麦中T-2毒素的酶联免疫眼附测定(ELISA) Determination of T-2 toxin in wheat with enzyme-Iinked im黯lUnosorbentassay (ELISA) 2003-08-11发布2004心1-01实施中华人民共秘国卫生变左布中国国家标准化管理委员回GB/T 5009.118-2003 88 前言本标准代替GB/T14933 1994，按GB/T20001. 42001。9.12 ELlSA缓冲液系统。9.12
2、.1 包被缓冲液为pH9.6的碳重量盐缓冲液，称取1.59 g碳酸纳(Na，CO，), 2. 93 g碳酸氢铀(NaHCO，)，加水稀释至1000mL. 9.12.2 洗液为含0.05%吐温20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T)，配制方法为2称取0.2g磷酸二氢掷(KH，PO，2.9g磷酸氮二锵(Na，HPO， 12日，0)，8.0g氯化镇(NaCD，0.2日氯化仰(KCl),0. 5 mL吐温-20，加水3至1000mL. 9.12.3 底物缓冲液为pH5.0的磷酸-拧襟酸缓冲液，配制方法为:0.1 mol!L拧橡酸(C，H，O，.比0)，p称取19.2g样橡酸，加水至1000m
3、L，为甲液;0.2 mol!L磷酸氢二锅(Na，HPO，那称取71.7 g磷酸氢二锁，加水至1号召OmL.为乙液g取甲液24.3mL，乙液饵.7mL，11O水!E100 mL，即可。9.12.4 底物滚滚z款5号LTMB(10 mg TMB溶于1mL二甲主盖率戴按中溶液+10mL底物缓冲液十10L30%过氧化氢，混匀。立13下2霉素标准溶液用甲醇配制1mg/mL T-2毒素贮备液，一20C冰箱贮存.于检测当天，精密吸取贮备液，用20%甲薄弱PBS(配刽方法同P玲也-T，不如吐滋-20即可串串释成制备标准也线的所需浓度。91 GB/T 5009.118-2003 10 仪器所有玻璃器皿均用硫酸洗
4、液浸泡，用自来水、蒸馆水冲洗。10.1 酶标检测仪.10.2 酶标板(40孔或96孔)。10.3 电动振摇器.10.4 电热恒温水浴锅。10.5 具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。门分析步骤11. 1 提取称取20g粉碎并通过20目筛的试样，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲统元水乙醇(4+1).密塞，振荡1h.通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置90C水浴上通风挥于。用50mL石油磁分次溶解蒸发皿中残渣，洗人250mL分液漏斗中，再用20mL甲碎水(4+1)分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5 min，静置约15min，收下层甲醇水提取液过层析柱净化(层析柱
5、的装备z在层析柱下端与小管相连结处寒约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲紧将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙醋，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙酶，冷至室温后转入浓缩瓶中府适量乙酸乙醋洗涤蒸发皿，并人浓缩瓶中。将浓缩瓶置95C水浴锅上，挥于冷却后，用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA检测之用。11. 2 ELSA检测11. 2.1 用下去BSA(4g/mL)包被酶标板，每孔100L.4C过夜。11.2.2 酶标板用PBS-T洗3次，每次3nin后，加人不同浓度的T-2标准溶液(制作标准曲线
6、)或试样提取液(检测试样毒素含量与抗体酶结合物溶液。+100)的混合液。+1.每孔100L.该混合液应于使用的前一天配好.4C过夜备用).置37C1. 5 h。11. 2. 3 酶标板洗3次，每次3min后，加入底物溶液。每孔100L.37C30 mino 11. 2. 4 用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50L.于450nm处测定吸光度值。12 结果计算按式(2)计算:式中gX=cXXDX_!_ V2z X-T-2浓度，单位为纳克每克(ng/g); c 酶标板上所测得的T-2毒素的量(ng).根据标准曲线求得，VJ 试样提取液的体积，单位为毫升(mL);V2一一滴加样液的体积，单位为毫升(mL)，D一一样液的总稀释倍数;m一试样质量，单位为克(g)。13 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。92 ( 2 )
