1、ICS 67.040 C 53 B 中华人民共和国国家标准G/T 5009. 23-2003 代替GBjT5009.23-1996 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定Determination of aflatoxins 1 ,2 ,G1 ,G2 in foods 2003-08-11发布2004酬。1-01实施中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员哥GB/T 5009.23-2003 前言本标准代替GB!T5009. 23-1996(食品中黄曲霉毒素矶、民、G1、G2的测定方法。本标准与GB/T5009.23-1996相比主要修改如下s一修改了标准的中文名称，标准中文名称改
2、为食品中黄曲霉毒素凯、B，、G1、马的测定们按照GB!T20001. 4-2001(标准编写规则第4部分z化学分析方法对原标准的结构进行了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准第法由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、中华人民共和国青岛迸出口商品检验局负责起草。本标准第二法由北京市卫生防疫站、中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、卫生部食品卫生监督检验所负责起草。本标准于1985年首次发布，于1996年第一次修订，本次为第二次修订。190 食品中黄曲事毒素B，、B2、G，、G2的测定1 范围本标准规定了各种食品中黄曲霉毒素岛、鸟、G，、马的测定方法。本标准适用于各种食品中黄
3、曲霉毒素B，、Bz、G，、G，的测定。GB/T 5009.23-2003 在薄层板上的最低检出量s黄曲霉毒素岛、G，为0.004问，也、马为0.002问。本方法检出限2黄曲霉毒素B，、G，为5g/kg.B，、G，为2.5g/kg。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 5009. 22-2003 食品中黄曲霉毒素队的测定第一法薄层色谱法3 原理试样经提取、
4、浓缩、薄层分离后，在365nm紫外光下，黄曲霉毒素良、B，产生蓝紫色荧光，黄曲霉毒素G，、G，产生黄绿色荧光，根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量来定量。4 试剂4.1同GB/T5009. 22-2003中3.13. 13 0 4.2 次氯酸销溶液(消毒用):配制方法见GB/T5009. 22-2003中3.16。4.3 苯乙醇水(46+35+19)展开剂=取此比例配制的溶液置于分液漏斗中，振摇5min，静置过夜。将上下层溶液分别置于具塞瓶中保存，上下层交界的溶液弃去不耍。若溶液出现混浊，则在80C水浴上加热，待清晰后，即停止加热，取上层溶液作展开剂用。另取一定量的下层溶液置小皿中，再放于展
5、开槽内.将薄层板放入展开槽内，预先饱和10min后展开。4.4 硫酸。+3)。4.5 黄曲霉毒素B，、B，、G，、G，标准溶液如下z4.5.1 单一标准溶液(10g/mL):准确称取黄曲霉毒素凯、G，标准品各1mgl. 2 mg.黄曲霉毒素B，、马标准品各O.5 mgO. 6 mg.用苯-乙腾混合液作溶剂。配制方法、浓度及纯度的测定参照GB/T 5009. 22-2003中3.14。黄曲霉毒素岛、马、G，、G，的分子量及用苯乙腊作溶剂时的最大吸收峰的波长及摩尔消光系数见表10黄曲霉毒素名称B, B, GG, 最大吸收峰波长/nm346 348 353 354 表1摩尔消光系数19800 20
6、900 17 100 18 200 4.5.2 各标准使用液z以下各标准液均用苯乙腊混合液配制。分子量312 314 328 330 191 GB/T 5009.23-2003 4.5.2.1 黄曲霉毒素混合标准使用液1，每毫升相当于0.2g黄曲霉毒素矶、G，及0.1问黄曲霉毒素B2、马，作定位用。4.5.2.2 黄曲霉毒素混合标准使用液11每毫升相当于0.04g黄曲霉毒素矶、G，及0.02问黄曲霉毒素B2、G作最低检出量用。5 仪器同GB/T5009.22-2003中4.14.9 0 6 分析步骤6.1 取样同GB/T5009.22-2003中5.106.2 提取同GB/T5009.22-2
7、003中5.2。6.3 测定6.3.1 单向展开法6.3. 1. 1 薄层板的制备同GB/T5009. 22-2003中5.3.1.1。6. 3. 1. 2 点样同GB/T5009. 22-2003中5.3. 1. 2。滴加式样如下=第一点，10L黄曲霉毒素混合标准使用液E。第二点，20L样液。第二点，20L样液十10L黄曲霉毒素混合标准使用液E。第四点，20L样液十10L黄曲霉毒素混合标准使用液I。6. 3. 1. 3 展开与观察黄曲霉毒素B，、B2、G，、G2的比移值依次排列为B，B，G，G2。在展开槽内加10mL元水乙酶，预展12cm，取出挥干，再于另一展开槽内加10mL丙酣三氯甲烧(8
8、+92)，展开10cm ., 12 cm，取出。在紫外光灯下观察结果，方法如下。6. 3. 1. 3. 1 由于样液点上加滴黄曲霉毒素混合标准使用液I或11，可使黄曲霉毒素B，、B2、G，、G2分别与样液中的黄曲霉毒素B，、B，、G，、G2荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B，、B，、G，、G2依次为0.0004、0.0002、0.0004、0.0002问，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B，、民、G，、G2的最低检出量是否正常出现。如为阳性，则起定位作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B，、B2、G，、G2依次为0.002、0.001、0.002、0.001吨，主要起定位作用。
9、6.3. 1. 3. 2 若第二点在与黄曲霉毒素矶、B，的相应位置上元蓝紫色荧光点;或在与黄曲霉毒素G，、仇的相应位置上元黄绿色荧光点，表示试样中黄曲霉毒素矶、G，含量在5g/kg以下;B，、G2含量在2.5g/kg以下才日在相应位置上有以上荧光点，则需进行确证试验。6. 3. 1. 4 确证试验6. 3. 1. 4. 1 黄曲霉毒素与三氟乙酸反应产生衍生物，只限于B，和G，泊2和G2与三氟乙酸不起反应。队和G，的衍生物比移值为B，G，o于薄层板左边依次滴加两个点。第一点:10L黄曲霉毒素混合标准使用液110第二点:20L样液。于以上两点各加三氟乙酸1小滴盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热
10、风2min，使热风吹到薄层板上的温度不高于400C。再于薄层板上滴加以下两个点。第三点，10L黄曲霉毒素混合标准使用液E。192 GB/T切09.23一2003第四点，20L样液。再展开(同6.3.1.3)，在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B，或G，标准点相同的衍生物，未加三氟乙酸的二、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。6.3. 1. 4. 2 黄曲霉毒素岛和马的确证试验，可用苯乙醇水(46+35+19)展开，若标准点与样液点出现重叠，即可确定。6. 3. 1. 4. 3 在展开的薄层板上喷以硫酸。+3)，黄曲霉毒素矶、B2、G，、马都变为黄色荧光。6. 3. 1. 5 稀
11、释定量样液中黄曲霉毒素B，、B2、G，、G2荧光点的荧光强度如各与黄霉毒素B，、B2、G，、G2标准点的最低检出量(B，、G，为0.0004降，B2、G2为0.0002g)的荧光强度一致，则试样中黄曲霉毒素B，、G，含量为5月/kg，B2、G2含量为2.5g/kgo如样液中任何一种黄曲霉毒素的荧光强度比其最低检出量强，则需逐一进行定量，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。定量与计算方法参照GB/T5009.222003中5.3.1.5与5.3. 1. 6。6.3.2 双向展开法6.3.2.1 i商加两点法6.3.2. 1. 1 点样=取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加黄曲
12、霉毒素标准使用液与样液。即在三块板的距左边缘。.8cm，-._，.lcm处各滴加10L黄曲霉毒素混合标准使用液II，在距左边缘2.8cm-3.0 cm处各滴加20L样液，然后在第二板的样液点上加滴10L黄曲霉毒素混合标准使用液II，在第三板上的样液点上加滴10L黄曲霉毒素混合标准使用液L6.3.2.1.2 展开=同GB/T5009. 222003中5.3. 2. 1. 2。6. 3. 2. 1. 3 观察及评定结果如下6. 3. 2. 1. 3. 1 在紫外光灯下观察第一、二板，若第二板的第二点在黄曲霉毒素B，、B2、G，、G2标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现
13、荧光点，则试样中黄曲霉毒素B，、G，含量在5g/kg以下;B2、G2的含量在2.5g/kg以下。6. 3. 2. 1. 3. 2 若第一板在与第二板的相同位置上各出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置的荧光点是否各与其黄曲霉毒素B，、岛、马、G2标准点重叠，如果重叠，再按6.3. 2. 1. 3. 3进行所需的确证试验。6.3.2. 1. 3. 3 黄曲霉毒素矶、G，的确证试验:取薄层板两块，于第四、第五两板距左边缘0.8cm-1 cm处各滴加10L黄曲霉毒素混合标准使用液E及1滴三氟乙酸，距左边缘2.8cm-3 cm处，第四板滴加20L样液及1滴三氟乙
14、酸;第五板滴加20L样液、10L黄曲霉毒素混合标准使用液E及1滴三氟乙酸。产生衍生物的步骤及展开方法同GB/T5009. 222003中5.3. 2. 1，观察样液点是否各产生与其黄曲霉毒素B，或G，标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。如样液黄曲霉毒素B，、B2、G，、G2含量高时，则将样液稀释后按6.3. 1. 4作确证试验。稀释定量与结果计算参照GB/T5009. 222003中5.3. 2. 1. 5与5.3. 2. 1. 6 0 6.3.2.2 i商加一点法同GB/T5009. 222003中5.3.2.2。所不同的地方是在薄层上滴加标准液时以黄曲霉毒素混合标
15、准使用液H代替黄曲霉毒素B，标准使用液(0.04月/mL)。稀释定量与结果计算参照GB/T 5009. 222003中5.3.2.2与5.3.1.6。第二法徽桂筛选法7 原理试样提取液通过由氧化铝与硅续吸附剂组成的微柱层析管，杂质被氧化铝吸附，黄曲霉毒素被硅续吸附剂吸附，在365nm紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正193 GB/T 5009.23-2003 比，由于微柱不能分离矶、B，、G，、马，故结果为黄曲霉毒素的总量。8 试剂8.1 石油隧沸程60C90C或30C60C。8.2 中性氧化铝=层析用100目200目。8.3 酸性氧化铝=层析用100吕200目
16、。8.4 元水硫酸铀g过40目80目筛或80目100目筛08.5 硅续型吸附剂s层析用100目200目。8.6 甲醇水溶液，(55+4日。8.7 展开ilJ，丙嗣-三氯甲炕0+的。8.8 脱脂棉:用索氏提取器以二氯甲统为溶剂提取2h后，挥干后贮于瓶中保存。8.9 黄曲霉毒素Bl标准液z用苯乙脯(98十2)配成0.4g/mL的贮存液及O.1g/mL的使用液，避光冷藏。注:层析用氧化铝、硅模型吸附剂、无水硫酸倒应在120C活化2h.密塞，贮干燥器内可保存一周.9 仪器9.1 紫外光灯，8W100 W，带有波长365nm滤光片。9.2 微柱管E内径。.4cm，长12cm的玻璃管，为加液方便上加一段粗
17、管。9.3 微柱管架。9.4 微量注射器，50mL, 10 分析步骤10.1 提取10. 1. 1 粮食、花生及其制品:取粉碎过筛(20日)试样20.00g于具塞锥形瓶中，加100mL甲醇水溶液，30mL石油隧，密塞振摇30min，静置片刻，过滤于50mL具塞量筒中，收集50mL甲醇水滤液(注意切勿将石油隧层带入滤液中)，转入分液漏斗中，加50mL硫酸销溶液(20g/L)稀释，加三氯甲统10 mL，轻摇2min.3 min，静置分层，三氯甲烧层通过装有5g元水硫酸俐的小漏斗脱水(以少量脱脂棉球塞住漏斗颈口，并以少量三氯甲烧润湿).并滤人10mL比色管中，再向分液漏斗中加3mL三氯甲烧重提一次，
18、脱水后滤入原比色管中，以少量三氯甲烧洗漏斗并定容至10.0mL.密塞，混匀，待测。此祥液1mL相当1.0g试样。10. 1. 2 植物油2称混匀泊样10.00g于20mL的烧杯中，用50mL石油田蓝分数次洗入分液漏斗中，加50 mL甲醇水轻摇2min.3 min，静置分层，将下层甲醇水转人另一分液漏斗中，加50mL硫酸纳水溶液(20g/L)稀释，加三氯甲统10mL.以下按10.1.1自轻摇2min.3 min起操作。此样液1mL 相当1.0g试样。10. 1. 3 发酵酒、酱油、醋等水溶性试样=啤酒等含二氧化碳的试样，需在烧杯中于水浴上加热、搅拌、除去气泡，否则易乳化。称混匀试样20.00g于
19、小烧杯中，以80mL硫酸纳溶液(20g/L)洗入分液漏斗中，加三氯甲烧10mL.此样液1mL相当2.0g试祥。10. 1. 4 腐乳、黄酱类z称取混匀试样20.00g于具塞锥形瓶中，加甲醇水100mL，石油隧20mL。振荡30min，静置片刻，以折叠快速定性滤纸过滤于50mL具塞量筒中，收集甲醇水滤液50mL(相当于10 g试样，因为10g试样中约含有5mL水).置于分液漏斗中，加入三氯甲烧10mL.以下按10.1.1自轻摇2min-3 min起操作。此样液1mL相当1.0g试样。10.2 测定10.2.1 微柱管的制备2以少量脱脂棉做底用租铁丝砸实，置于微柱管架上，依次加入高为0.5cm元水
20、194 GB/T 5009.23-2003 硫酸锅(80目100日).0.5cm硅侯型吸附剂，0.5cm无水硫酸销(80目100目).1.5cm中性氧化铝.1.5 cm酸性氧化铝，3cm元水硫酸纳(40目80目).顶部以少量脱脂棉堵塞，装试剂时管要垂直，每装一种试剂要适当敲紧，两种试剂之间界面要平齐，柱管要随装随用，以免在空气中吸水活性下降。10.2.2 微柱层析E在装好的微柱中，加入三氯甲烧提取液1.0 mL.同时做标准管，另取三支微柱管，各加入三氯甲炕1mL.再分别加入黄曲霉毒素B，标准液(0.1g/mL)O、50、100L.相当于黄曲霉毒素B，标准。、5、10吨，待加液流至顶层时，即加入
21、1mL丙阁三氯甲烧0+的展开剂，在加样或展开时，柱管均要保持垂直，待展开剂流完后，即可观察结果。10.2.3 结果观察与评定=于波长365nm紫外光灯下观察，将层析后的样品管依次与0、5、10ng黄曲霉毒素B，标准管比较，若试样柱管内硅侯型吸附剂层与0管一致则为阴性(在5g/kg以下).如试样管中硅续吸附剂层皇蓝紫色荧光环，则为阳性，并需进一步按薄层层析法进行确证测定，但不需重新提取试样。其操作如下z准确吸取原三氯甲烧提取液4.0mL(相当4g或8g试样)于小蒸发皿内挥干，以少量苯乙脯混合液(98十2)分数次转入刻度小管中，定容至1.0 mL.密塞，混匀，按薄层层析法确证，并测定黄曲霉毒素B，、B2、G，、G2的含量。195
