1、中华人民共和国国家标准GB/T 5009.24 1996 食品中黄曲霉毒素M1与岛的测定方法代替GB5009. 24 85 Method ror determination of aflatoxins M, and B, in roods 1 主题内容与适用范围本标准规定了牛乳及其制品、黄油及新鲜猪组织(肝、肾、血及瘦肉)等食品中黄曲霉毒素M，与乱的测定方法。本标准适用于牛乳及其制品、黄油及新鲜猪组织(肝、肾、血及瘦肉)等食品中黄曲霉毒素M，与矶的测定。2 引用标准GB/T 5009.22 食品中黄曲霉毒素矶的测定方法3 原理样品经提取、浓缩、薄层分离后，黄曲霉毒素M，与B，在紫外光(波长36
2、5nm)下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。4 试剂4. 1 同GB/T5009. 22中第3章。4.2 异丙醇。4. 3 硅胶Gz层析用。4.4 氯化纳及氯化纳溶液(40g/L)。4. 5 硫酸。+3)。4.6 玻璃砂:用酸处理后洗净干燥，约相当20目。4. 7 黄曲霉毒素M，标准溶液s用三氯甲:烧配制成每运升相当于10阔的黄曲霉毒素M，标准溶液。以三级甲烧作空白试剂，黄曲霉毒素M，的紫外最大吸收峰的波长应接近357nm .摩尔消光系数为19 9500避光，置于4C冰箱中保存。4. 8 黄曲霉毒素M，与B，混合标准使用液s用三氯甲烧配制成每毫升相当于各含0.04吨
3、黄曲霉毒素M，与乱。避光，置于4C冰箱中保存。5仪器扣JGB/T 5009.22中第4章。6 分析步骤整个操作需在暗室条件下进行。!. 1 样品提取中华人曳共和国卫生部1996-06-19批准1996-09-01实施531 GB/T 5009.24-1996 6. 1. 1 样品提取制备表见下表。称样量加水量样品名称g ml. 4乳30 。炼乳30 。牛草L粉15 20 乳酶15 5 黄油10 45 猪肝30 。猪肾30 。猪瘦肉30 。猪血30 。提取液量可由式(1)计算。式中:X1一提取液量，mL;加甲醇量提取液量加40g/l.氧化销溶液量ml. 90 90 90 90 55 90 90
4、90 90 ml. ml. 62 25 52 35 59 28 56 31 80 。59 28 61 26 58 29 61 26 X1=立X(90 + A十B)15 浓缩体积滴加体积方法灵敏度mL L g/kg 0.4 100 O. 1 0.4 50 。.2 O. 4 40 O. 5 O. 4 40 O. 5 0.4 40 O. 5 0.4 50 0.2 O. 4 50 o. 2 0.4 50 o. 2 0.4 50 0.2 ( 1 ) A 样品中的水分量.mL(牛乳、炼乳及猪组织的取祥量为30g.牛乳粉、乳酷的取样量为15日); B 加水量.mL。1直z样品中的水分量参照中国预防医学科学院
5、蕾养与食品卫生研究所编著的4食物成分表儿因各提取液中含48mL甲醇，需39mL水才能调到甲醇与水之体积比为(55+45).因此加入氯化纳溶液(40g/U量等于87mL减去提取液量(mL)。6. 1. 2 牛乳与炼乳:称取30.00 g混匀的样品，置于小烧杯中，再分别用90mL甲醇移于300mL具塞锥形瓶中，盖严防漏。振荡30min，用折叠式快速滤纸滤于100mL具塞量筒中。按上表收集62mL牛乳与52时，炼乳(各相当于16g样品)提取液。6. 1. 3 牛乳粉z取15.00g样品，置于具塞锥形瓶中，加入20mL水，使样品湿润后再加入90mL甲醇，以下楼6.1. 2自振荡30min起，依法操作。
6、按上表收集59mL提取液相当于8g样品)。6. 1.4 乳酸:称取15.00g切细、过10日圆孔筛混匀样品，置于具塞锥形瓶中，加5mL水和90mL甲醇，以下按6.1. 2自振荡30rnin起依法操作，按上表收集56mL提取液(相当于8g样品)。6. 1. 5 黄油z称取10.00g样品，置于小烧杯中，用40mL石油酷将黄泊溶解并移于具塞锥形瓶中。加45 mL水和55mL甲醇，振荡30min后，将全部液体移于分液漏斗中。再加入1.5 g氯化纳摇动溶解，待分层后，按上表收集80mL提取液(相当于8g样品)于具塞量筒中。6. 1. 6新鲜猪组织s取新鲜或冷冻保存的猪组织样品(包括肝、肾、血、瘦肉).
7、先切细，混匀后称取30.00g.琵于小乳钵中，加玻璃砂少许磨细，新鲜全血用打碎机打匀，或用玻璃珠振摇抗凝。混匀后称取30. 00 g将各样品置于300mL具塞锥形瓶中，加入90mL甲醇，以下按6.1. 2自振荡30min起依法操作。按上表收集59mL猪肝.61mL猪肾.58mL猪瘦肉及61mL猪血等提取液(各相当于16g样品。6.2 净化6. 2. 1 用石油酷分配净化:将以上收集的提取液移入250mL分液漏斗中.再按各种食品加入-定休积的氛化纳溶液(40g/L) (见上表)。再加入40mL石油酶，振摇2min，待分层后，将下层甲醇-氯化纳水层移于原量筒中，将上层石油隧溶液从分液漏斗上口倒出，
8、弃去。再将量筒中挥军液转移于原分液漏斗中。再重复用石油醋提取2次，每次30mL，最后将量筒中溶液仍移于分液漏斗中。黄油样液总共用石J由酷提取2次，每次40mL532 GB/T 5009. 24一19966.2.2 用三氯甲烧分配提取z于原量筒中加入20mL三氯甲烧，摇匀后，再倒入原分液漏斗中，振摇2 mino待分层后，将下层兰氯甲:境移于原量筒中，再重复用三氯甲烧提取两次，每次10mL合并于原最筒中。弃去上层甲醇水溶液。6. 2. 3 用水洗三氯甲烧层与浓缩制备:将合并后的三氯甲烧层倒回原分液漏斗中.加入30mL氯化纳溶液(40g/U，振摇30S，静置。待上层混浊液有部分澄清时，即可将下层三氯
9、甲烧层收集于原量筒中。加入10g元水硫酸锅，振摇放置澄清后，将此液经装有少许无水硫酸纳的定量慢速滤纸过滤于100mL 蒸发皿中。氯化纳水层用10mL三氯甲炕提取一次，并经过滤器一并滤于蒸发皿中。最后将无水硫酸销也起倒于滤纸上，用少量兰氯甲烧洗量筒与无水硫酸纳，也-并滤于蒸发皿中。于65C水浴上通风挥T。用三氯甲烧将蒸发皿中残留物转移于浓缩管中。蒸发皿中残渣太多.则经滤纸滤入浓缩管中。于65 C用减压吹气法将此液浓缩至0.4mL以下，再用少量三氯甲烧洗管壁后，浓缩定量至0.4mL备用。6.3 测定6. 3. 1 硅胶G薄层板的制备z薄层板厚度为0.3mm , 105 C活化2h，在干燥器内可保存
10、12d, 6.3.2 点板z取5cmX20 cm的薄层板两块，距板下端3cm的基线上各滴加两点，在距第一与第二板的左边缘。.81 cm处各滴加10L黄曲霉毒素M，与8，混合标准使用液，在距各板左边缘2.83 cm 处各滴加同一样液点(各种食品的滴加体积见上表)，在第二板的第2点上再滴加10L黄曲霉毒素M，与8，i昆合标准使用液。一般可将薄层板放在盛有干燥硅胶的层析槽内进行滴加，边加边用冷风机冷风吹L6. 3. 3 展开z6. 3.3. 1 横展在槽内加入15mL事先用无水硫酸锅脱水的无水乙酷(500mL无水乙酿中加20日无水硫酸纳入将薄层板靠近标准点的长边景于槽内，展至板端后，取出挥手，再向上
11、继续展开一次。6. 3. 3. 2 纵展:将横展两次挥干后的薄层板再用异丙醇丙嗣苯-iE己烧一石油酷(沸程6090C)三氯甲烧(5+10+10+10十10十55)混合展开剂纵展至前沿距原点距离为1012cm取出挥干。6. 3. 3. 3 再横展将纵展挥干后的板再用乙酷横展12次.展开方法同6.3.3.106. 3. 4 观察与评定结果:6. 3. 4.1 在紫外光:tJ下将第、二极相互比较观察，若第二板的第2点在黄曲霉毒素M，与8，标准点的相应处出现最低检出量(M，与8，的比移值依次为0.25和O.43) ，而在第板相同位置主未出现荧光点，则样品中黄曲霉毒素M，与8，含量在其所定的方法灵敏度以
12、下(见上表)。6. 3. 4.2 如果第一板的相同位置上出现黄曲霉毒素M，与战的荧光点，则第二板第2点的样液点是否各与滴加的标准点重叠，如果重叠，再进行以下的定量与确证试验。6. 3. 5 稀释定量样液中的黄曲霉毒素M，与此荧光点的荧光强度与黄曲霉毒素M，与队的最低检出培(0.0004g)的荧光强度致，则牛乳、炼乳、牛乳粉、乳酷与黄油样品中黄曲霉毒素M，与队的含量依次为0.1，0.2，0.5，0.5及0.5g/kg，新鲜猪组织(肝、肾、血、瘦肉)样品均为0.2g/kg(见上表)。如样液中黄曲霉毒素M，与8，的荧光强度比最低检出量强，则根据其强度逐进行测定，估计减少滴加微升数或经稀释后再滴加不同
13、微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。6. 3. 6 确证试验:在做完定性或定量的薄层板上，将要确证的黄曲霉毒素Ml与8，的点用大头针圈出。喷以硫酸溶液(1+3)，放置5min后，在紫外光灯下观察，若样液中黄曲霉毒素M，与8，点同标准点-样均变为黄色荧光，则进一步确证检出的荧光点是黄曲霉毒素M，与B，。6. 3. 7计算1 000 X, = 0.000 4 X ;, X D X一-V2 m 式I11X2黄曲霉毒素M，或B，含量，g/kg，V，一样液浓缩后体积，mL;V，出现最低荧光祥液的滴加体积.mL;( 2 ) 533 GB/T 5009. 24一1996D一一浓缩样液的总稀释倍数，m一一浓缩祥液中所相当的样品质量，gj O. ()OO 4 黄曲霉毒素M，或B，的最低检出量吨。结果的表述报告测定值的整数位。附加说明z本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草。卒标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。,)34
