1、GB 838187 本标准参照采用国际标准ISO 66511983（E）饲料中黄曲霉素B1的测定方法。1 适用范围 本标准适用于各种单一饲料和配合饲料。 2 原理 样品中黄曲霉素B1经提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外灯光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。 3 试剂 3.1 三氯甲烷（GB 68278）。 3.2 正己烷（HG 3100376）。 3.3 甲醇（GB 68379）。 3.4 苯（GB 69077）。 3.5 乙腈（HG B 332960）。 3.6 无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水（HG B 100276）。 3.7 丙酮（G
2、B 68678）。 以上试剂于试验时先进行一次试剂空白试验，如不干扰测定即可使用。否则需逐一检查进行重蒸。 3.8 苯-乙腈混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈混匀。 3.9 三氯甲烷-甲醇混合液：取97mL三氯甲烷，3mL甲醇混匀。 3.10 硅胶：柱层析用80200目。 3.11 硅胶G：薄层色谱用。 3.12 三氟乙酸。 3.13 无水硫酸钠（HG 312376）。 3.14 硅藻土。 3.15 黄曲霉毒素B1标准溶液3.15.1 仪器校正：测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素：精密称取25mg经干燥的重铬酸钾（基准级）。用0.009molL硫酸溶解后准确稀释至200
3、mL（相当于0.0004molL的溶液）。再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中，加0.009molL硫酸稀释至页码，1/8GB 8381872006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB838100A.htm刻度（相当于 0.0002molL溶液）。再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中，加0.009molL硫酸稀释至刻度（相当于0.0001molL溶液）。用1cm石英杯，在最大吸收峰的波 长处（接近350nm）用0.009molL硫酸作空白，测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸光度。并按下式计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。 再以此平均值与重铬酸钾
4、的摩尔消光系数值3160比较，按下式求出使用仪器的校正因素。 若f大于0.95或小于1.05，则使用仪器的校正因素可略而不计。 3.15.2 10 gmL黄曲霉毒素B1标准溶液的制备：精密称取1mg1.2mg黄曲霉毒素B1标准品，先加入2mL的乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，置于4冰箱保存。 用紫外分光光度计测此标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值，并按下式计算该标准溶液的浓度。 根据计算，用苯-乙腈混合液调到标准液浓度恰为10 gmL，并用分光光度计核对其浓度。 3.15.3 纯度的测定：取5 L10 gmL黄曲霉毒素B1标准溶液滴加于涂层厚度0.25mm的硅胶G薄层板上。用甲醇
5、一氯仿（4：96）与丙酮：氯仿（892）展开剂展开，在紫外光灯下观察荧光的产生，必须符合以下条件： a. 在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点。 b. 原点上没有任何残留的荧光物质。 3.16 黄曲霉毒素B1标准使用液：精密吸取1mL10 gmL标准溶液于10mL容量瓶中，加苯-乙E1 A m（1）式中： E1重铬酸钾溶液的摩尔消光系数；A 测得重铬酸钾溶液的吸光度；m 重铬酸钾溶液的摩尔浓度。f3160 M（2）式中： f使用仪器的校正因素；M 测得重铬酸钾摩尔消光系数平均值。X1（ A M1000f）E2（3）式中： X1黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度， gmL；A 测得的吸光度值；
6、M黄曲霉毒素B1的分子量，312；E2 黄曲霉毒素B1在苯-乙腈混合液中的摩尔消光系数，19800。 页码，2/8GB 8381872006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB838100A.htm腈混合液至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1 g黄曲霉毒素B1。吸取1.0mL此稀释液置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.2 g黄曲霉毒素B1。另吸取1.0mL此液置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.04 g黄曲霉毒素B1。 3.17 次氯酸钠溶液（消毒用）：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均
7、匀。另将80g工业用碳酸钠 （Na2CO310H2O）溶于500mL温水中，再将两液混合，搅拌、澄清后过滤。此滤液含次氯酸钠浓度约为 2.5。若用漂白粉精制备则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的浓度约为5，污染的玻璃仪器用1 次氯酸钠溶液浸泡半天或用5次氯酸钠溶液浸泡片刻后即可达到去毒效果。 4 仪器 4.1 小型粉碎机。 4.2 分样筛一套。 4.3 电动振荡器。 4.4 层析管内径22mm，长300mm，下带活塞，上有贮液器。 4.5 玻璃板：520cm。 4.6 薄层板涂布器。 4.7 展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm。 4.8 紫外光灯：波长365nm。 4.9 天平。 4.10
8、具塞刻度试管10.0mL，2.0mL。 4.11 旋转蒸发器或蒸发皿。 4.12 微量注射器或血色素吸管。 5 操作方法 5.1 取样 样品中污染黄曲霉毒素高的毒粒可以左右测定结果。而且有毒霉粒的比例小，同时分布不均匀。为避免取样带来的误差必须大量取样，并将该大量粉碎样品混合均匀，才有可能得到确能代表一批样品的相对可靠的结果，因此采样必须注意。 5.1.1 根据规定检取有代表性样品。 5.1.2 对局部发霉变质的样品要检验时，应单独取样检验。 页码，3/8GB 8381872006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB838100A.htm 5.1.3 每份分析
9、测定用的样品应用大样经粗碎与连续多次四分法缩减至0.51kg，全部粉碎。样品全部通过20目筛，混匀，取样时应搅拌均匀。必要时，每批样品可采取三份大样作样品制备及分析测定用。以观察所采样品是否具有一定的代表性。 5.2 样品的制备 如果样品脂肪含量超过5，粉碎前应 脱脂。如果经脱脂，分析结果以未脱脂样品计。 5.3 提取 取20g制备样品，置于磨口锥形烧瓶中，加硅藻土（3.14）10g，水10mL，三氯甲烷（3.1）100mL，加塞，在振荡器上振荡30min，用滤纸过滤，滤液至少50mL。 5.4 柱层析纯化 5.4.1 柱的制备 柱中加三氯甲烷（3.1）约23，加无水硫酸 钠（3.13）5g，
10、使表面平整，小量慢加柱层析硅胶（3.10）10g，小心排除气泡，静止15min，再慢慢加入10g 无水硫酸钠，打开活塞，让液体流下，直至液体到达硫酸钠层上表面，关闭活塞。 5.4.2 纯化 用移液管取50mL滤液，放入烧杯中，加正己烷（3.2）100mL，混合均匀，把混合液定量转移至层析柱中，用正己烷洗涤烧杯倒入柱中。打开活塞，使液体以8 12mLmin流下，直至到达硫酸钠层上表面，再把100mL乙醚（3.6）倒入柱子，使液体再流至硫酸钠层上表面，弃去以上收集液体。整个过程保证柱不干。 用三氯甲烷-甲醇液（3.9）150mL洗脱柱子，用旋转蒸发器烧瓶收集全部洗脱液。在50以下减压蒸馏，用苯-乙
11、腈混合液（3.8）定量转移残留物到刻度试管中，经50以下水浴气流挥发，使液体体积到2.0mL为止。洗脱液也可在蒸发皿中经50以下水浴气流挥发干，再用苯-乙腈转移至具塞刻度试管中。 如用小口径层析管进行层析，则全部试剂按 层析管内径平方之比缩小。 5.5 单向展开法测定 5.5.1 薄层板的制备：称取约3g硅胶G（3.11），加相当于硅胶量二至三倍 左右的水，用力研磨12min至成糊状后立即倒入涂布器内，推成520cm，厚度约0.25mm的薄层板 三块。在空气中干燥约15min，在100活化2h，取出放干，于干燥器中保存。一般可保存二至三天，若放置时间较长，可再活化后使用。 5.5.2 点样：将
12、薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加四个点，点距边缘和点间距约为1cm，点直径约3mm。在同一块上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下： 第一点：10 L0.04 gmL 黄曲霉毒素B1标准使用液；第二点：16 L样液； 第三点：16 L样液10 L0.04gmL黄曲霉 毒素B1标准使用液；页码，4/8GB 8381872006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB838100A.htm 第四点：16 L样液10 L0.2gmL黄曲霉毒 素B1标准使用液。 5.5.3
13、展开与观察：在展开槽内加10mL无水乙醚预展12cm，取出挥干，再于 另一展开槽内加10mL丙酮-三氯甲烷（8：92），展开1012cm，取出，在紫外光灯下观察结果，方法如下： a. 由于样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准使用液，可使黄曲霉毒素B1标准点与样液中的黄曲霉毒 素B1荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B1为0.0004 g，可用作检查在样 液内黄曲霉毒素B1最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定位作用。薄层板上的第四点中黄曲霉 毒素B1为0.002 g，主要 起定位作用。 b. 若第二点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B1含
14、量在5 gkg以下；如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。 5.5.4 确证试验：为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲 霉毒素B1的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在0.1左右。 方法： 于薄层板左边依次滴加两个点。 第一点：16 L样液； 第二点：10 L0.04 gmL黄曲霉毒素B1标准使用液；于以上两点各加1小滴三氟乙酸（3.12）盖于样点上，反应5min后，用吹风机吹热风2min，使热风吹到薄层板上的温度不高于40。再于薄层板上滴加以下两个点； 第三点：16 L样液； 第四点：10 L0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液。再展开同前。在紫
15、外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。 5.5.5 稀释定量：样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量（0.0004 g）的荧光强度一致，则样品中黄曲霉毒素B1含量即为5 gkg。如样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同的微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量 的荧光强度一致为止。滴加式样如下： 第一点：10 L0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液；第二点：根据情况滴加10 L样液； 页码，5/8GB 8381872006-3
16、-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB838100A.htm 第三点：根据情况滴加15 L样液； 第四点：根据情况滴加20 L样液。 5.5.6 计算和结果的表示 5.6 双向展开法测定 如用单向展开法展开后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素B1的荧光强度，需采用双向展开法。 薄层板先用无水乙醚（3.6）作横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边而黄曲霉毒素B1不动，然后再用丙 酮-三氯甲烷（892）作纵向展开，样品在黄曲霉毒素B1相应处的杂质底色大量减少。因而提高了方法灵敏度，如用双向展开法中滴加两点法，展开仍有杂质干扰时则可改用滴加一点法。 5.6.1 滴加两
17、点法 5.6.1.1 点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加黄曲霉毒素B1标准溶液与样液。即在三块板的距左边缘0.81cm处各滴加10 L0.04 gmL黄曲霉毒素B1标准使用液，在距左边缘2.83cm处各滴加16 L样液，然后在第二块板的样液点上加滴10 L0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液。在第三块板的样液点上加滴10 L0.2gmL黄曲霉毒素B1标准使用液。 5.6.1.2 展开 a. 横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加入10mL无水乙醚。将上述点好的 薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干，或根据情况需要时可再重复展开12次。 b. 纵向展开：挥干
18、的薄层板以丙酮：三氯甲烷（8：92）展开至1012cm为止。丙酮与 三氯甲烷的比例根据不同条件自行调节。 5.6.1.3 观察及评定结果 在紫外灯下观察第一、二板。若第二板的第二点在黄曲霉毒素B1标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点，则样品中黄曲霉毒素B1含量的5gkg以下。 若第一板在与第二板的相同位置上出现荧光点，则将第二块板与第三块板比较，看第三X20.0004（ V1 D） V2（1000 m）（4）式中： X2样品中黄曲霉毒素B1的含量， gkg；V1加入苯-乙腈混合液的体积，mL；V2出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；D 样液的总稀释倍数；m
19、加苯-乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g；0.0004黄曲霉毒素B1的最低检出量， g。页码，6/8GB 8381872006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB838100A.htm块板上第二点与第一板上第二点的相同位置上的荧光点是否与黄曲霉毒素B1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，第一、二、三板可以同时作，也可按照顺序作。如果按顺序作，当在第一板出现阴性时，第三板可以省略。如第一板为阳性，则第二板可以省略，直接作第三板。 5.6.1.4 确证试验：另取两块薄层板。于第四、第五两板距边缘0.81cm处各滴加10 L0.04gmL黄曲霉毒素B
20、1标准使用液及1小滴三氟乙酸（3.12）；距左边缘2.83cm处，第四板滴加16 L样液及1小滴三氟乙酸。第五板滴加16 L样液，10 L0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液及1小滴三氟乙酸，产生衍生物的步骤同单向展开法，再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。 如样液黄曲霉毒素B1含量高时，则将样液稀释后，按5.5.4作确证试验。 5.6.1.5 稀释定量：如样液黄曲霉毒素B1含量高时，按5.5.5 稀释定量操作，如黄曲霉毒素B1含量低稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，影响结果的判断，可将样液作双向展开
21、测定，以确定含量。 5.6.1.6 计算：同5.5.6。 5.6.2 滴加一点法 5.6.2.1 点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加黄曲霉毒素B1标准使用液与样液。即在三块板距左边缘0.81cm处各滴加16 L样液，在第二板的点上加滴10 L0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液，在第三板的点上加滴10 L0.2gmL黄曲霉毒素B1标准使用液。 5.6.2.2 展开：同5.6.1.2的横向展开与纵向展开。 5.6.2.3 观察及评定结果：在紫外灯下观察第一、二板，如第二板出现最低检出量的黄曲霉毒 素B1标准点，而第一板与其相同位置上未出现荧光点，样品中黄曲霉毒素B1在5 gkg以下。
22、如 第一块板在与第二块板黄曲霉毒素B1标准点相同位置上出现荧光点，将则第一板与第三板比较， 看第三板上与第一板相同位置上的荧火点是否与黄曲霉毒素B1标准点重叠，如果重叠，再进行以 下确证试验。 5.6.2.4 确证试验：于距左边缘0.81cm处，第四板滴加16 L样液及1小滴三氟乙酸（3.12）；第五板滴加16 L样液，10 L0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液及1小滴三氟乙酸。产生衍生物及展开方式同5。再将以上二板在紫外光灯下观察以确定样液点是否产生与黄曲霉毒素B标准点重叠的衍生物，观察时可将第一板作为样液的衍生物的空白板。 经过以上确证试验定为阳性后，再进行稀释定量，如含黄曲霉毒素B1低不需稀释或稀释倍数小，杂质荧光仍有严重干扰，可根据样液中黄曲霉毒素B1荧光的强弱，直接用双向展开法定量，或与单向展开法结合，方法同上。 5.6.2.5 计算：同5.5.6。 页码，7/8GB 8381872006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB838100A.htm页码，8/8GB 8381872006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB838100A.htm
