1、ICS 6502030B 41S E中华人民共和国水产行业标准SCT 720212007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法Diagnostic ProtocolsPan 1：20070614发布for Penaeus monodon-Type Baculovirus(MBV)ofPenaeid Shrimp-Microscopy Method with Wet Mount20070901实施中华人民共和国农业部发布前 言SCT 720212007SCT 7202斑节对虾杆状病毒病诊断规程分为三个部分：第1部分：压片显微镜检查法；第2部分：PCR检测法；第3部分：组织病理学诊断
2、法。本部分为SCT 7202的第1部分。本部分的附录A、附录B为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦。斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法SCT 7202120071范围SCT 7202的本部分规定了斑节对虾杆状病毒病压片显微镜检查法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分适用于对虾活体及其粪便中的斑节对虾杆状病毒(MBV)核型多角体的检测，其中对粪便的检查可用于进行非致死
3、性的疾病筛查和诊断。不适于对病毒非感染性携带的标本进行诊断，以及对宿主进行组织病理学评价。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SCT 720232007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法3原理31斑节对虾杆状病毒病的病原和病理学特征见SCT 720232007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)中31的规定。32通过光学显微镜
4、观察新鲜组织样品或粪便中近球形的MBV核型多角体形成的情况，可初步诊断被检样品是否感染MBV。直接压片法是利用包涵体较高的折射率进行区分，孔雀石绿染色法是利用包涵体着色较深区分，压片焰红染色法是用荧光显微镜观察经焰红染料染色的包涵体激发出的荧光来判断。4试剂和材料41 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水。42 0057L雀石绿染液按附录A的规定。43 0001焰红染液按附录A的规定。44自然海水经沉淀去除悬浮物。5仪器设备51显微镜：压片孔雀石绿染色法只需要普通明视野显微镜即可，直接压片法推荐使用相差显微镜，压片焰红染色法需要荧光显微镜(阻挡滤光片波长为520 nln，激发
5、滤光片波长为450 rim-490 nna)。52载玻片。53盖玻片。54医用镊子。55解剖刀。5 6水族箱。1SCT 72021200757塑料虹吸管并接有一段塑料吸管尖头。58玻璃试管。59吸水纸。6操作步骤6 1样品的准备611样品采集的要求见附录B。612组织样品：幼体取整体，仔虾取头胸部，幼虾和成虾取小块肝胰腺或小截中肠组织。61 3粪便样品：将幼虾或成虾暂养于水族箱中，待数小时直至水族箱底部出现粪便。用干净的塑料虹吸管吸取排泄物，注入玻璃试管中。62直接压片法将组织或粪便样品置于载玻片上，用解剖刀将样品切碎，盖上盖玻片，用明视野显微镜调小光圈观察，或用相差显微镜观察。63压片孔雀石
6、绿染色法将组织或粪便样品置于载玻片上，用解剖刀将样品切碎，滴加1滴-2滴005孔雀石绿染液，混匀，染色2 rIlin4min，盖上盖玻片，用吸水纸吸取多余的液体，将制备好的压片置于明视野显微镜下观察。64压片焰红染色法将组织或粪便样品置于载玻片上，用解剖刀将样品切碎，滴加1滴2滴0001焰红染液，混匀，染色2 min-4 min，盖上盖玻片，用吸水纸吸取多余的液体，将制备好的压片置于荧光显微镜下观察。7结果判定7。1直接压片法：显微镜下可观察到受MBV感染的对虾肝胰腺或中肠的上皮细胞核肿大，核内有单个或多个折射率高的球形包涵体，单个包涵体直径约为01n-20肛10受MBV感染的对虾粪便压片可观
7、察到带折光性的近似球形的包涵体，大小约20,urn，在新鲜粪便中，MBV包涵体常成团聚集，并被核膜包裹着。72压片孔雀石绿染色法可观察到包涵体着色发绿，与正常的细胞核、核仁、分泌颗粒或吞噬溶酶体和脂肪滴等其他球形体相比，包涵体着色更深。73压片焰红染色法在荧光显微镜下可见蓟在浅绿色的背景中，核型多角体的包涵体呈明亮的黄绿色荧光，而组织中的其他成分没有荧光。74观察结果找到多个有大量或簇集的典型包涵体的视野可作为确诊的依据；诊断结果可疑时，补充组织病理诊断法或PCR检测进行结果确认。2A 1 005孔雀石绿染液孔雀石绿(水溶性)加水溶解定容至室温贮存。附录A(规范性附录试剂配方A2 1焰红贮存液
8、焰红B(水溶性)水溶解后置于棕色瓶中，室温贮存。A3 0 001焰红染液1焰红贮存液水SCT 7202120070059100mL1 g100mL01mL100mL3SCT 720212007B1采样目的附录B(规范性附录)甲壳类动物疾病诊断采样原则与方法甲壳类动物的疾病诊断通常出于三个目的之一：疾病流行状况的监测；种苗或场地的健康证书；疾病发生后的诊断。对于不同目的进行分析，所需的样品类型和数量极不相同。B1 1疾病发生后的诊断在临床发病的情况下，应该从活的或濒死的甲壳类动物中仔细选择带有特征性病灶的高质量标本，强调标本应具有代表性，并且是濒死的或ll缶床发病的。避免采集死后的标本，采样时要
9、根据诊断方法，考虑样品所需的保存条件。要对已发生的疾病进行诊断，建议最少采集100个幼体标本，50个后期幼体(如仔虾、仔蟹)标本、10个稚体(如幼虾、稚蟹)或成体(如成虾、亲蟹等)的标本。如果临床病症明显，可采集更多的数量。不过，上述推荐的“最少”数量只是一个指导性的参考量，必须强调，仔细选择标本的质量比随便捡出上百个标本来充数要更有价值得多。B12对无症状的甲壳类动物的诊断要监测疾病流行情况、或检测无症状感染的病原、或核准健康证书，所需的采样数量就应该用统计学方法来确定。先假定感染的检出率大于或等于2、5、10、20等，再对不同大小的群体计算所需的最少样品数量，该数量应该能使样品中出现感染标
10、本的概率满足95的可信限。对不同大小的群体，所需要的采样数量已被计算成预定的表格(见表B1)。为了监测疾病流行或核准健康证书，对不同大小的群体进行诊断所需的样品数量应与表1相符，并取其最低的假定检出率，即2。为了诊断群体中似乎存在的无症状感染，可假定检出率高于5，从表1查出所需的采样数量。表B1 各种大小的群体在推测病原检出率不同时满足95可信限的采样数量各假定检出率的采样数量群体大小2 5 10 20 30 40 5050 50 35 20 10 7 5 2100 75 45 23 10 9 7 6250 llO 50 25 10 9 8 75 130 55 26 10 9 8 71 000
11、 140 55 27 10 9 9 81 500 140 55 27 10 9 9 82 000 145 60 27 10 9 9 84 000 145 60 27 10 9 9 810600 145 60 27 lO 9 9 8100 000 150 60 30 10 9 9 8注：表格中的采样数量是指实际被有效分析的样品数，如果所采集到的样品不一定每份都能分析到，则需采集更多样品。例：对于100 000尾仔虾的群体来说，在60尾样品中查出3尾阳性，则该群体存在5病原检出率的结果具有95的可信度。4SCT 720212007对不同病原的监测，还应注意最适于采样的生活期有差异。例如，要监测对虾
12、杆状病毒病、斑节对虾杆状病毒病或杆状病毒的中肠腺坏死，最佳采样期是幼体和早期仔虾；要监测拖拉病、白斑病和黄头病，最佳采样期是幼虾和亚成年虾；要监测螯虾瘟，最佳采样期是幼螫虾和成年螯虾。B2不同诊断方法所需样品的采集要求B 21直接显微镜检查或组织印片涂片染色检查的样品用于直接镜检的样品应在采集后立即处理，起码要求能做到制备好风干的组织印片或涂片。待检样品尽可能使用活标本，如果得不到活标本，至少也应使用冰鲜或用缓冲的10甲醛(37)固定的标本。B2 2组织学诊断的样品B221采样时样品要求采样时，应尽量减轻对动物造成的胁迫，固定前需要运输或临时暂养时要保证水中有充足的含氧量。B222固定液要求准
13、备好充足的固定液，一般原则是一体积的组织样品最少需要十倍体积的固定液(例如，10 g对虾组织需要100 mL固定液)。大多数组织学诊断都可使用戴维森氏AFA固定液(见附录A)。该固定液可快速渗透，能有效阻止甲壳类的组织自溶，且其酸性可使甲壳脱钙。如果样品要准备进行免疫组织化学分析或进行RNA病毒的原位杂交诊断，可采用非酸性的RF固定液(见附录A)。但RF固定液不应该用于常规组织学样品的固定，因为它对组织的渗透较慢，且不能使甲壳脱钙，用它固定的组织可能会导致切片和染色困难。B223不同样品的固定方法幼体和仔虾：用细筛绢或吸管选取标本。将采集的个体直接浸入10倍体积的固定液中，固定12 h-24
14、h，然后转移到70乙醇中长期保存。大的仔虾和小的幼虾：按上述方法选取并采集标本。用注射针尖或解剖刀尖划破甲壳，将采集的个体直接浸入10倍体积的固定液中，固定12 h-24 h，然后转移到70乙醇中长期保存。大的幼虾以及成虾：用注射器将体重510的固定液注射到活虾体内。先对肝胰腺区域分2处3处进行注射，然后将固定液注射到第1、第3和第6腹节。头胸部，特别是肝胰腺区域应该多注射一些。注射使虾完全死亡，然后立即用解剖刀片划开甲壳，在头胸区的划口沿着头胸甲中线的右侧，在腹节区的划口沿着腹节右侧的中部。再将个体浸入10倍体积的固定液中，固定24 h，然后转移到70乙醇中长期保存。体重大于129的虾或蟹：
15、按上述方法注射并划破甲壳，然后将虾体在头胸和腹节连接处的后面横切，如果虾体较大，再在腹节中部横切。将各部分浸人10倍体积的固定液中，固定24 h，如果个体较大或甲壳较硬，应延长固定时间，直到72 h，然后转移到70乙醇中长期保存。个体很大的虾或蟹：注射固定液后，对个体解剖，取出需要进行组织学分析的组织或器官，分别浸入10倍体积的固定液中，固定12 h24 h，然后转移到70乙醇中长期保存。B224样品编号、登记和标签在采集样品时应对标本进行编号和登记，并根据编号记载标本的全部说明档案，包括标本种名、龄期、重量或大小、来源、个体症状、群体健康状态以及其他相关信息。要使用抗水的纸条或毛面塑料纸做样
16、品标签，并用B2铅笔在标签上注明标本登记编号及其主要说明，将标签直接放人与该标本相同的含固定液包装中，不要用钢笔、圆珠笔或记号笔作标签。B225样品的包装和运输5SCT 7202。卜一2007大体积的固定液或含乙醇溶液不能进行邮寄或运输，样品运输前需要进行相应的处理。在运输前12h，将样品从70乙醇中转移到50的乙醇中保存，以降低样品中的乙醇含量。包装前将样品从50乙醇中取出。幼体、仔虾或小的幼虾标本转移到具密封圈的螺12I聚丙烯塑料管中，放入标签，再填充少许吸水纸，然后用50乙醇浸透，盖紧管帽；较大的标本用3层5层白色纸巾完全包裹，将纸巾包裹的标本放入一个厚的聚丙烯塑料袋中，用50乙醇浸透纸
17、巾。在袋内放人标签，将塑料袋用热塑封口机熔封。将上述塑料管或塑料袋用2层吸水纸包裹，放人一个厚塑料袋中并完全密封。多个小塑料袋再封人一个较大的塑料袋内，最后所有的塑料袋放入一个抗压的运输用包装箱内，填人防压充填物，进行邮寄或运输。B226组织学标本修整的取材从50或70的乙醇保存液中取出固定好的标本，置于木头或塑料垫板上，根据标本的大小进行修整，以便确保感兴趣的组织能被有效切片。幼体或仔虾：用擦镜纸将个体包好，放于脱水盒中进行脱水，包埋时去掉擦镜纸，用热镊子调整标本在包埋模具中的位置进行整体包埋。小于3 cln的幼虾：用单面刀片或解剖刀沿对虾的中线右侧将标本纵剖两半。如果虾体较长，再从第2腹节
18、处横切两半。取包含中线的左侧进行脱水，包埋时纵切面向下包埋。大于3 Cm的幼虾或亚成年虾：用单面刀片或解剖刀从对虾的头胸和腹节连接处切断，再将头胸沿中线右侧纵剖两半。取包含中线的左侧，切去步足80的长度，剔净胃内容物；如果头胸长度大于1 cm，切取包含胃部和肝胰腺部分的l以下的部分；如果厚度大于05 cxn，削去高出05 cm的部分。再从不含中线的右侧头胸部斜切下鳃区。将切取的含中线左侧头胸部和切下的鳃区放入同一个脱水盒进行脱水，包埋时将含中线左侧头胸部的纵切面向下，鳃区的纵切面向上，前后对错地放入同一个包埋模具中包埋。如果需要对腹节部分进行组织学分析，选取感兴趣的腹节或第1、第3和第6腹节，
19、从第1和第3腹节横切出厚度不超过05 c【r-的段，对第6腹节纵切，分别脱水和包埋。大于8an的虾或蟹：参照上述修整方法，按照长宽不超过1 cm1 cin、厚度不超过05 cnl的要求，对感兴趣的组织所在区域进行修整；对特定的组织或蟹的组织，也可考虑进行横切，甚至独立地解剖出相应的组织器官，按需要分别进行脱水和包埋，胃和肠道中的内容物应剔除干净以免损伤切片刀。B23分子生物学或免疫学诊断的样品B231样品采集和保存要点用于PCR、RT-PCR或核酸探针斑点杂交检测的样品，应该注重保护病原的核酸；用于抗体的免疫分析检测的样品，应该注重保护病原的抗原活性。用于核酸检测或抗体检测的样品，应该十分小心
20、地防止各样品间的交叉污染，每个样品必须使用新的一次性塑料袋或塑料管和内置标签。不同的样品采集和保存方法，对不同检测方法的适用性有差异，并且可能需要增加一些辅助的样品处理手段，因此在样品采集和运输时要注明曾使用过的保存条件，使实验室能根据其保存条件进行相应处理。B232不同类型样品的采集和运输B2321活标本：活标本可在现场处理或以活体形式运输到诊断实验室。B2322血淋巴：许多分子生物学或免疫学检测的首选样品是血淋巴，样品可用注射器从心脏、腹部血窦采集，或切断附肢采集。B2323冷藏标本：需经24 h以内运输到实验室，进行分子生物学或免疫学检测的样品可采用这种方法保藏。运输前，应将各样品独立装
21、袋，用足量的冰将样品塑料袋埋入泡沫塑料箱中，进行合适的包装后运输到实验室。6SCT 720212007B2324深冻标本：采集活标本，用干冰或用低于一20的冰柜速冻，将标签放入独立的样品包装袋，用足量的干冰将样品包装袋埋入泡沫塑料箱中，进行合适的包装后可满足较苛刻的运输要求。B2325乙醇保存的样品：对于难以用冷藏或冷冻方法存放和运输样品的情况，可用90-95的乙醇来保存和运送某些类型的样品。小于2 g3 g的个体、解剖出的组织或抽取的血淋巴可保存于90-95的乙醇中，做好相应标签，运输前1 h，将保存的标本转移到50的乙醇中，然后按本附录B225的方法进行包装和运输。B2326特殊采样液保存的样品：一些特定的分子生物学或免疫学检测方法或试剂盒提供了样品的采集、保存和运输用试剂，可为样品的保存、运输和后续的检测操作提供便利。如SEMP-SSC采样液可用于斑点杂交检测的核酸样品的保存和运输、SEMP-Tris采样液可用于PCR和核酸探针检测的核酸样品保存和运输，Trid“可用于RT-PCR样品的保存和运输等。但要注意，不同的采样液保存的样品通常只适用于该试剂指定的检测方法，而并不一定适于进行其他的诊断。7
