1、 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1867-2007 进出口贝类中软骨藻酸的检测方法液相色谱-串联质谱法Determination of domoic acid in shellfish for import and export LC-MS/MS method 2007-04-06发布2007-10-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1867-2007 目。昌本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:方晓明、唐毅锋
2、、樊祥、卫锋。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 范围进出口贝类中软骨藻酸的检测方法液相色谱-串联质谱法本标准规定了进出口贝类样品中软骨藻酸的液相色谱串联质谱检测方法。本标准适用于进出口贝类样品中的软骨蔼酸检测。2 测定方法2.1 方法提要SN/T 1867-2007 试样中的软骨蔼酸用甲醇水提取，固相萃取柱净化后，液相色谱分离，串联质谱检测，外标法定量。2.2 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馆水或相适应的去离子水。2.2.1 甲醇:液相色谱级。2.2.2 乙睛:液相色i晋级。2.2.3 甲酸:纯度大于等于98.0%。2.2.4 软骨藻酸标准品(domoic
3、acid，分子式ClH21 NC丸，CASNo. 14277-97-5):纯度大于等于97.0%。2.2.5 甲醇:水(50:50，体积比)。2.2.6 乙睛:水(10:90，体积比)。2.2. 7 o. 1 mol/L甲酸水溶液。2.2.8 0.05%甲酸的乙腊溶液:取0.50mL甲酸加入至1L乙睛中。2.2.9 0.05%甲酸水溶液。2.2. 10 软骨薄酸标准储备液(100g/mL):准确称取O.010 g软骨蔼酸于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。此储备液于180C中可保存半年。2.2.11 软骨蔼酸中间溶液(10g/mL):移取1.00 mL软骨薄酸标准储备液(2.2.10
4、)于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。此榕液于180C中可保存3个月。2.2.12 空白样品提取液:空白样品提取液的制备同2.4.202.2.13 软骨薄酸基质标准工作溶液:根据需要吸取适量软骨藻酸标准储备液(2.2.10)或软骨薄酸中间溶液(2.2.11)，用空白样品提取液配制成适当浓度的基质标准工作溶液。基质标准工作溶液在180C保存，可使用1周。2.2.14 SAX固相萃取柱:3 mL(500 mg)，使用前小柱预先用6mL甲醇、3mL水和3mL甲醇水榕液(2. 2. 5)淋洗，流速为2mL/mi口。2.3 仪器和设备2.3. 1 液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾离子源。2.3.2 固相
5、萃取装置。2.3.3 恒温氮吹装置。2.3.4 组织捣碎机2.3.5 均质机。 SN/T 1867-2007 2.3.6 旋涡泪合器。2.3.7 离J心b机:最大转速40Oo r/min 2.3.8 离J心心管:5Om丑lL。2.4 测定步骤2.4. 1 样品的制备从抽取的原始样品中取可食部分，放入组织捣碎机中搅碎至匀浆状，均分成两份，装入清洁的容器内，作为试样。密封，并标明标记。将试样于18C以下冷冻保存。在制样操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。2.4.2 提取及净化称取试样4g(精确到O.Olg)，置于50mL离心管中，加入2X8mL甲醇:水(50: 50，体积比)，于12
6、 000 r/min均质3mi口，于3800 r/min离心10mi口，合并上清液，再用甲醇:水(50:50，体积比)加补到20.0mL，取5.0mL上清液(相当于含1.0g样品)过SAX固相萃取柱，加5mL乙睛:水(10:90，体积比)和O.5 mL O. 1 mol/L甲酸溶液淋洗，流速2mL/min，最后用3.0 mL O. 1 mol/L甲酸溶液洗脱，并收集，柱中液体流完后，保持抽气2min，最后用0.1mol/L甲酸溶液定容到3.0mL，供测试。2.4.3 测定2.4.3. 1 液中目色谱条件a) 色谱柱:150 mm X 2. 1 mm，粒径3.5m， Zorbax XDB-CI8
7、 ，或相当者;预柱20mmX 3.9 mm , 粒径5m，Symmetry Cl8柱，或相当者;b) 流动相:榕剂A，0.05%甲酸的乙睛榕液;榕剂B，0.05%甲酸水溶液;c) 梯度淋洗:梯度淋洗见表1; d) 流速:0.2mL/mi川e) 柱温:22C;f) 进样量:10L。表1梯度淋洗表时间/min溶剂A/C%)o 5 20 20 30 5 2.4.3.2 质谱条件a) 离子化模式:电喷雾正离子模式(ESI十); b) 锥电压:50V; 源温度:105C; d) 喷雾温度:250C; 巳)毛细管电压:3.0kV; f) 碰撞电压:10V; g) 碰撞气:氧气;h) 锥气流速:60L/h;
8、喷雾气流速:480L/h; j) MS1(m/z) :312;TOF MS(m/z) :l00500， 2.4.3.3 液中目色谱-串联质谱测定溶剂B/C%)95 80 95 梯度曲线6 6 6 按浓度由小到大的顺序，依次分析基质标准工作溶液(2.2.13)，得到浓度与峰面积的工作曲线。样品溶液中被测物的响应值应在工作曲线范围内。在上述液相色谱串联质谱条件下，软骨薄酸的保留时2 SN/T 1867-2007 间约17.5min，色谱图和质谱图参见附录A中图A.1和图A.20样品中被测物保留时间与标准品一致，选择的两个特征子离子m/z312m/z266，m/z312 m/z294同时存在，且两者
9、丰度比与标准品丰度比的偏差小于10%，以此来确证样品中存在软骨藻酸。选择丰度最大的特征子离子的峰面积，或所有子离子力口和的峰面积进行外标法定量。2.4.4 空白试验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。2.4.5 结果计算和表述试样中被测物含量利用数据处理系统计算或按式(1)计算，计算结果应扣除空白值。式中:X二cX主rn X 试样中被测组分残留量，单位为微克每克(g/g);E 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V 试样溶液定容体积，单位为毫升(mL);m 试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。3 测定低限、回收率3.1 测定低限本方法的测定低限为o.1g
10、/go 3.2 回收率软骨藻酸在贻贝和蛤州中添加浓度及其回收率数据:添加浓度在o.1g/g时，回收率为78%104%; 添加浓度在10g/g时，回收率为81%1l0%; 添加浓度在20g/g时，回收率为81%107%。. ( 1 ) 3 SN/T 1867-2007 附录A(资料性附录)液中目色谱固和质谱图17.48 L 101 MSMS ES+ TIC 2.80e4 100 6(lJi) 7 (cpi-lJi) 1, 1m MSMS CS 4 111 TJC :; 78 e3 % ill-飞飞、nu 。O. 00 5.00 10.00飞飞11110 30.00 固A.1软骨藻酸(DA)及其异
11、构体组织标样的总离子色谱图j nunu nu l 312.21 266. 20 I 238. 16 1 294; 20 I 312.21 100, , r , . 266. 20 11261161币5.1飞203;15248. 1飞|叫2010 312.22 。;J(, i11 312.22 266. 20 248. 19 ，. n， nn 1 16L 15 2?3; 16 . 1 ,294; 20 I 312.22 198. 13 248. 19 266. 2Q. _ I 15千12j ,- , I I 29 191 266.20 312.22 100, 1126.1116LI5193;17
12、川19叫19叫20 266.20 312.22 1001 , 1 ,29 191 266. 20 312. 22 10C习J 126. 11 161. 1岳叫17220州?叫294120 I 266. 20 312. 22 1001 lAO-;-(;- I j .00 .0. 0000 .?48.191 294.201 c1 12. 10 161. 1 1吨18220:191!i|100 125 150 17且20022且2且o27且30032且1001 ,00 2.8. 20266. 20 31千20i 154. 07 193. 1_7勾O.8 I 294; 18 I 04.飞.，鸟., I
13、 I J 100 12岳1岳o175 200 225 250 27且30032岳(1) 1: TOF MSMS 312. OOES+ 87 1: TOF MSMS 312. OOES+ (2) 9岳1: TOF MSMS 312. OOES+ (3) 470 (4) 1: TOF MSMS 312. OOES+ 1. 01c3 (岳1: TOF MSMS 312. OOES+ 479 (6) 1: TOF MSMS 312. OOES+ 1. 41c4 (7) 1: TOF MSMS 312. OOES+ 1. 34c3 3且o375 400 42且4且o47且且00(8) 1: TOF MS
14、MS 312. OOES+ 15 ., mz 3且o37岳400425 4且o475岳00Figure A. 2 -Full-scan mass spectra of domoic acid and its isomers 10 khCON-h-问Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口贝类中软骨藻酸的检测方法液相色i普-串联质谱法SN/T 1867-2007 -兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷当咛开本880X12301/16 印张1字数20千字2007年6月第一版2007年6月第一次印刷印数1-2000 定价10.00元-兴书号:155066 2-17796 SN/T 1867-2007
