1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1871-2007 美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法Identification of Monilinifructicol(Winter) Honey 2007-04-06发布2007-10-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局目。昌本标准的附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:吴品珊、严进。本标准系首次发布的行业标准。SN/T 1871-2007 SN/T 1871-2007 美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了植物检
2、疫中美澳型核果褐腐病菌Moniliniafructicola (Winter) HoneyJ的检疫鉴定方法。本标准适用于针对美澳型核果褐腐病菌的核果类等蔷薇科果实和苗木的检疫。2 原理2.1 分类地位fruit 英文名:pathogen of brown rot , pathogen of twig canker, pathogen of American brown rot of stone 学名:Monilinia fructicola (Winter) Ho口巳y曾用名:Sclerotiniafructicola (Winter) Rehm. 无性态:Monilia fructicola
3、 Batra 美澳型核果褐腐病菌Monili1fructicola(Winter) HoneyJ属真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)子囊菌纲(Ascomycetes)，柔膜菌目(Helotiales)，核盘菌科(Sclerotiniaceae)，链核盘菌属(Monili时)。病菌既能在果园引起危害，又能为害储藏期果实。它还可对果实进行潜伏侵染，使病菌在储藏期继续传播扩散，造成严重损失。能引起核果类等水果褐腐病的真菌还有核果褐腐病菌Monilinialxa和欧洲种仁果褐腐病菌Moniliniafructigena，它们不仅能引起相似的症状，在形态上也与Monilinialru
4、ctic近似。病菌在世界上的分布和寄主植物参见附录Ac2.2 鉴定原理根据美澳型核果褐腐病菌在寄主上的症状、形态学特性、生物学特征和PCR特异性扩增片段做为鉴定依据。3 仪器和用具3.1 仪器生物显微镜(具测量功能)，体视显微镜，超净工作台，光照生物培养箱，天平，高压灭菌器，台式高速离心机，pH计，水浴箱，PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。3.2 用具塑料盒，测量用尺子，烧杯，三角瓶，量筒，试管，培养皿(直径9cm)，载瑛片，盖玻片，酒精灯，黑光灯(18W , 320 nm380 nm)，塑料研样，移液器，移液器吸头，离心管，液氮罐。4 试剂和培养基4.1 试剂琼脂粉，乳酸，马铃薯，葡萄糖，琼
5、脂糖，无菌双蒸水，液氮，V8液，CaCO , SDS, Tris-H Cl , MgC12 , HC1 , EDTA ,JaOH , NaOAC, KC1 , Tris , CTAB, TBE，无水乙醇(Ethanol)，苯酣(Phenol)，漠化乙链(EB) ，三氯甲:院(Chloroform)，异丙醇(Isopropanol)，异戊醇(Isoamylalcohol) ，蛋白酶K，T叫聚合酶，dJTP，DJA分子量Marker(100b肘，特异性引物lTSI-Mfcl和lTS4-Mfcl。SN/T 1871-2007 4.2 培养基微酸性水洋菜培养基，马铃薯葡萄糖培养基CPDA), V8培养
6、基。5 鉴定方法5.1 症状检查检验苗木时，重点查验枝梢和叶部。症状为枯萎和渍扇，愤癌斑长圆形，中央稍凹陷，灰褐色，边缘紫褐色，有时发生流胶，潮湿条件下，病斑上可产生分生于包子梗束;叶部症状为干枯凋萎;如有花，则变褐、干枯或腐烂。剪取有疑似症状的枝、叶或花做分离培养。在果实检验时，取有褐色病斑的果做分离培养。冷库储藏期的病果，病斑为黑褐色，温度适合时病斑迅速扩大至全果，果肉随之变软、腐烂，或皱缩、干瘪成僵果。潮湿条件下，表面产生同心轮纹状排列的灰白色至灰褐色霉层，其上产生分生于包子梗束。被潜伏侵染的果，有些表面有微小的圆形的坏死斑点，出现灰白色轮纹状霉层。5.2 保湿培养无上述明显症状的果或看
7、似健康的果，做保温检查。果实在密闭的塑料盒中，20C25C下保温培养，7d后每天开始检查，直到第14天，出现褐腐病斑症状的果做分离培养。5.3 分离培养从病健交界处切取边长为5mm10 mm的样品，70%酒精消毒10s30 s，放在微酸性培养基上，25C培养，待菌落出现，镜检。如菌落、菌丝和分生于包子的形态特征与M.fructicol相似，则立即转到PDA皿上。5.4 生物学鉴定将转到PDA上的M.fructicola疑似菌在22C下黑暗培养4d，用4mm的打孔器在菌落边缘打孔取样，将菌落转移至另外的直径为9cm PDA培养皿中央，22C下，12h光照/12h黑暗培养，光照标准为320nm38
8、0 nm、18W黑光灯(近紫外灯)2支，置于培养皿上方约15cm处。培养皿观察保留到第12天。培养3d后开始每日测量菌落直径，直到第5天，计算菌落的生长速度。记录菌落的颜色、产咀量、于包子堆形状和生长速度。5.5 分子生物学鉴定5.5.1 DNA提取按CTAB方法提取DNA参见附录B。5.5.2 PCR引物M. fructila的特异性引物ITS1-Mfcl和ITS4-Mfcl序列分别为5-TATGCT CGC CAG AGG ATA ATT-3，和5-TGGGTT TTG GCA GAA GCA CAC T-3 , 5.5. 3 PCR tft曾50L PCR反应体系中含有:T叫聚合酶缓冲液
9、(20mmol/L Tris-HCl pH8. 4 , 50 mmol/L KCl) , 1. 5 mmol/L MgC12 ,1. 25 uni1s T叫聚合酶，各dNTP200m，各引物0.2m，5L稀释20倍的DNA样品。同时要设置阴性对照，以Tris-EDTA缓冲液代替D:-.JA样品。PCR反应条件为:预变性，94C3 mi口变性，94C30 s，退火67.5C 30 s，延伸72c 1. 5 mi口，30个循环最后延伸，72C10 min, 5.5.4 PCR产物的检测在0.5XTBE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm, O. 5% EB染色20min，凝胶成像仪分析
10、结果。5.6 菌种保藏将分离菌接在V8培养基的斜面上，待斜面表面布满菌丝后，封好斜面的盖子，置于一20C保存。2 6 鉴定特征6.1 生物学特性6.1.1 病菌形态SN/T 1871-2007 菌丝:微酸性培养基上，形成第一个隔膜前的初生菌丝，壁薄，长250m，宽7m10m，l个或多个分枝，随后的分枝很窄。分生于包子:芽生，链状排列，椭圆形或卵形，有时顶部平截，大小为(8m28m)x (5m 19m)大多数为(12m16m)x (8mllm)J，透明，聚集时为灰黄色。分生于包子梗较短，分枝或不分枝，顶端串生分生于包子。微酸性培养基上，于包子萌发产生的芽管较长，约700m900m，在远离子包子处
11、可有分枝，此特征与M.laxa的短且近于包子处分枝多的芽管区别显著。在老龄的菌落和腐烂的水果上可见瓶梗状性于包子，即小型分生于包子，直径2.5m3mc 菌核:离散的菌丝核较少在培养基上形成，菌丝与奇主组织一起形成菌核，在感病的果上可出现干的子座，子座层代替了大部分的果皮。子囊盘:仅在果园里的落地僵果上不规律地形成。浅褐色，杯状，具柄，成熟后直径5mm20 mm，子囊大小为(102m215m)x (3m13阳1)，之间有丝状侧丝c内生子囊子包子8个，单列，椭圆形，无色，单胞，大小为(6m15m)x (4m8m)c而M.fructicola的近似种M.l叫和M.fructigena很少产生子囊盘。
12、6.1.2 菌落特征M. fructila在PDA培养基上的生长速度很快，5d10 d后菌落可布满整个9cm的培养皿，每24 h生长9mm20 mm，平均13mm/24 h。菌落产子包丰富，菌落颜色为棒子色或灰黄色，边缘完整，质地均匀，同心轮纹明显。老龄菌落产生不规则子座壳和平圆形菌核。小型分生于包子大量聚集在菌落的边缘，为肉眼可见的黑色的突起。M.fructicola与近似菌的菌落特征比较参见附录C。6.2 PCR特异性产物M. fructicola的特异性扩增片段为356bpc 7 结果判定根据美澳型核果褐腐病菌的鉴定特征(第6章)，对分离菌进行综合判定。如分离菌的所有特性均与各鉴定指标吻
13、合，可鉴定为美澳型核果褐腐病菌Monili川fructicola(Winter) HoneyJ。3 SN/T 1871-2007 附录A(资料性附录)美澳型核果揭腐病菌的分布和寄主亚洲印度、日本、韩国、也门、中国北京、中国台湾。非洲津巴布韦、南非、埃及(待证实)。北美洲加拿大、墨西哥、美国。中美及加勒比海地区危地马拉、巴拿马。南美洲阿根廷、瑛利维亚、巳西、厄瓜多尔、巳拉圭、秘鲁、乌拉圭、委内瑞拉。大洋洲澳大利亚、新西兰。欧洲法国、奥地利、西班牙(待证实)、英国(待证实)。主要的奇主为蔷薇科果树，尤其是核果类李属CPrunus L. )的李、杏、桃、油桃、樱桃、梅李等，还有苹果、梨、葡萄，病菌还
14、可在木瓜属CChaenorneles Lindl. )、山植属CCrataeKL.)、批把属(Erio!JotryaLindl. )、植梓属CCydniaMill. )等奇主上为害。附录B(资料性附录)DNA提取方法将菌丝放入1.5 mL浸在液氮里的离心管中，用塑料样碾碎，加入300L500LCTAB缓冲液(其中含0.1g蛋白酶K)混匀，65C水浴1h;13000g离心5min 10 min，保留上清液;加500LTris 饱和酣:三氯甲皖:异戊醇(体积为25: 24 : 1)混匀，13000 g离心5min10 mi口，保留上清液;再加500L三氯甲皖:异戊醇(体积为24: 1)混匀，130
15、00g离心5min10 mi口，保留上清液;加入1mL 异丙醇泪匀，-70C下放置1h，或20C过夜;13 000 g离心30min，可见DJA沉淀;70%乙醇洗DNA沉淀，室温干燥;用30L50LTris-EDTA缓冲液溶解DJA，待用。4 SN/T 1871-2007 附录C(资料性附录)美澳型核果揭腐病菌菌落和形态特征表C.1美澳型核果褐腐病茵茵落a菌落性状Monilinifucticola Mon飞lin飞alt工。Monilini!uctlena 颜色揍子色或灰黄色揍子色或灰黄色黄色或奶油色生长长度(每24h内)9 mm20 mm 2 mmll mm o mm12 mm 产于包量丰富
16、稀少稀少是否有轮纹状有有时有有时有是否有莲座状否是否边缘是否裂状否是否a 在PDA培养基上、22C、12h近紫外光照/12h黑暗的培养。、2 1 僵果和病菌子囊盘;2 子囊及侧丝;3 子囊于包子;4 分生于包子及分生于包子链;5 分生于包子链一部分;6 萌发的分生于包子。图C.1形态特征5 khCON-h-问Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法SN/T 1871-2007 -兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷-兴开本880X12301/16 印张O.75 字数11千字2007年6月第一版2007年6月第一次印刷印数1-2000 定价8.00元当咛书号:155066 2-17800 SN/T 1871-2007
