1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1875-2007 入出境船舶压舱水微生物学检测规程Microbiological examination rules for ballast water of entry-exit ships 2007-04-06发布2007-10-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局目。吕本标准附录A、附录B、附录C均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国河北出入境检验检疫局。本标准主要起草人:王海军、李俊成、张j回合、聂维忠、李德昕、王林、黄廷学。本标准系出入境检验检疫首次发布的行业标准。SN
2、/T 1875-2007 入出境船舶压舱水微生物学检测规程1 范围本标准规定了人出境船舶压舱水微生物学检测的项目、程序和方法。本标准适用于对入出境船舶压舱水进行微生物学检测。2 规范性引用文件SN/T 1875-2007 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789.2 食品卫生微生物学检验菌落总数测定CB/T 4789.3 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定GB/T 4
3、789.4 食品卫生微生物学检验沙门民菌检验GB/T 4789. 5 食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验GB/T 4789. 6 食品卫生微生物学检验致泻性大肠埃希民菌检验GB/T 4789. 7 食品卫生微生物学检验副榕血性弧菌检验GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB 19489 实验室生物安全通用要求SJ/T 1239 国境口岸霍乱弧菌检验规程SJ/T 1757 入出境船舶压舱水卫生监测规程3 检测项目入出境船舶压舱水微生物学检测的重点项目包括:a) 卫生学指示菌;b) 沙门民菌;c) 志贺民菌;d) 致病性大肠埃希民菌;巳)霍乱弧菌;f) 副溶血性弧菌;g
4、) 甲型肝炎病毒;h) 轮状病毒。4 要求4.1 第3章巳)检测应符合GB19489中BSL-3实验室生物安全条件的相应规定，第3章列项中其他项检测应符合GB19489中BSL-2实验室生物安全条件的相应规定。4.2 检验人员应经过专业技术和实验室生物安全培训，并取得资格证书。5 实验室设备与试剂准备5.1 细菌学检测设备细菌学检测主要仪器设备有:H型生物安全柜;SN/T 1875-2007 恒温培养箱(370C士10C及440C士0.10C);高压蒸气灭菌器;干燥箱;普通光学显微镜。5.2 病毒学检测设备病毒学检测主要仪器设备有:H型生物安全柜;电镜;PCR检测仪;电泳仪;凝胶成像系统;高速
5、离心机;低温冰箱(-400C-800C); 分析天平(精确到O.000 1 g); 高压蒸气灭菌器;干燥箱。培养基与试剂细菌学检测项目的培养基与试剂的制备按GB/T4789.28规定执行。5.3 压舱水样品采集与处理压舱水样品采集按SJ/T1757规定执行。样品处理参见附录A。6 6.1 6.2 检测流程7 微孔滤膜过-h英粉滤过水样检测流程见图10培菌或i接分离培养)IJf第3辛巾b) DJ 可疑商落纯分离培养总人肠两群与类大肠商群检测检测流程固图12 8 检测方法8.1 细菌总数检测按GB/T4789.2规定执行。8.2 大肠菌群与粪大肠菌群检测按GB/T4789.3规定执行。8.3 沙门
6、氏菌检测按GB/T4789.4规定执行。8.4 志贺民菌检测按GB/T4789.5规定执行。8.5 致病性埃希民大肠杆菌检测按GB/T4789. 6规定执行。8.6 霍乱弧菌检测按SN/T1239规定执行。8. 7 副榕血型弧菌检测技GB/T4789.7规定执行。8.8 甲型肝炎检测参见附录B。8.9 轮状病毒检测参见附录C。9 检测结果与报告9.1 根据检测结果出具报告。9.2 对发现的新菌株和毒株及未能鉴定的菌株送专业实验室进一步鉴定。SN/T 1875-2007 3 SN/T 1875-2007 附录A(资料性附录)压舱水集菌和富集病毒方法A.1 过滤膜集菌方法A.1.1 器材滤膜集菌器
7、材主要有:过滤装置;灭菌微孔过滤膜:孔径。.45m、膜直径47mm，具3mm疏水边缘;灭菌过滤膜杯:容量100mL、直径47mm; 灭菌元齿慑子。A. 1.2 方法A. 1. 2.1 元菌操作取微孔过滤膜平铺于过滤膜杯底部。A. 1. 2. 2 将过滤膜杯固定于过滤装置上。A. 1. 2. 3 将水样注入过滤杯中，启动抽滤系统。A. 1. 2. 4 水样抽滤完毕，用无齿慑夹取微孔滤膜边缘部分，此滤膜可以直接置培养基中培养或增菌液中增菌。滤膜直接用于培养时，截留细菌面应向上，并与培养基面紧贴，两者间不得留有气泡。A.2 浓集病毒方法A. 2.1 石英粉抽滤法A. 2. 1. 1 材料石英粉抽滤材
8、料主要包括:水样20L; 1 mol/L盐酸(HCl);0.5 mol/L氧化铝(AIClj); 30m100m直径的石英粉柱;pH9. 0 O. 15 mol/L甘氨酸氢氧化纳溶液;透析袋;聚乙二醇PEG(分子量6000) 0 A. 2. 1. 2 操作步骤A. 2. 1. 2. 1 用1mol/L盐酸将海水样pH调至3.50A. 2. 1. 2. 2 按最终浓度O.000 5 mol/L加入0.5mol/L氯化铝(30mL)泪匀，静置30mino A. 2. 1. 2. 3 用石英粉柱抽滤，速度为10L/ho A. 2. 1. 2. 4 用甘氨酸氢氧化铀溶液分3次洗脱。A. 2. 1. 2
9、. 5 收集洗脱液，置透析袋中用PEG包埋，4C浓缩至6mL左右，冻存备检OA. 2. 2 高分子聚合物法A. 2. 2.1 器材4 高分子聚合物法器材主要有:烧瓶;移液器(100L200L;500L1200L); 分液漏斗;SN/T 1875-2007 漏斗架。A. 2. 2. 2 试剂需要试剂包括:青霉素100U/mL; 链霉素100g/mL;小牛血清0.1mol/L、磷酸盐缓冲液(先配0.1mol/L磷酸氢纳、0.1mol/L磷酸二氢铀72mL 和0.1mol/L磷酸氢二铀28mL混合即成pH二7.2)。A. 2. 2. 3 步骤A. 2. 2. 4 取压舱水样200mL A. 2. 2
10、. 4.1 加小牛血清0.2mL、青霉素0.2mL、链霉素0.2mL、0.1mol/L(pH7. 2)磷酸盐缓冲液3mL A. 2. 2. 4. 2 加入葡聚糖0.5g，振动至完全溶解，加聚乙二醇(6000分子量)14 g振动至完全溶解。A. 2. 2. 4. 3 加氧化铀3.5g，强力振动20min，至完全溶解。A. 2. 2. 4. 4 将上液倒入分液漏斗，置4C冰箱中静置18h22 ho A. 2. 2. 4. 5 弃去顶相废液，收集底相浓缩液备用。5 SN/T 1875-2007 附录B(资料性附录)甲型肝炎病毒检测方法B.1 免瘟电镜技术检测甲型肝炎病毒B.1.1 材料与试剂材料与试
11、剂包括:压舱水浓缩液O.2 mLO. 5 mL; 抗HAV血清0.1mL; 2%磷鸽酸。B. 1.2 操作步骤B. 1. 2. 1 取压舱水浓缩液0.2mL，加入抗HAV血清0.1mL，摇匀，置370C1 h，然后置40C过夜。B. 1. 2. 2 次日取出后，12000 r/min离心1.5 h，收集沉淀物。B. 1.2.3 沉淀物用O.1 mL、飞、O.2 mL蒸锢水重溶后滴铜网OB. 1. 2. 4 用2%磷鸽酸负染2min3 min B. 1.2.5 电镜下观察凝集成片的27口m大小的病毒颗粒为阳性OB.2 RT-PCR法检测甲型肝炎病毒(HAV)B. 2.1 材料与试剂材料与试剂包括
12、:压舱水浓缩液;RJA提取试剂盒;RT-PCR试剂盒;2%琼脂糖凝胶;O. 5g/mL漠化乙链;甲型肝炎病毒检测常用的引物为:P1:HAV十2020:5 ACA GAT ATA CAA AGT CAG 3 ; P2 :HAV-2210:5CCC CAG AAT CAT CTC CA3 0 B. 2. 2 操作步骤B. 2. 2.1 用RJA提取民剂盒提取样品的总RJAoB.2.2.2 用DEPC水10倍系列稀释至10-7，取10-、10-11、10-7做逆转录及PCR扩增，扩增时每个稀释度各做4个平行管。B. 2. 2. 3 RT-PCR反应:RT-PCR反应泪合液根据实验所做样品的份数及试剂
13、盒使用说明书进行配制，1昆匀后再将混合液按要求分人PCR各管内，放入PCR仪进行PCR反应。B. 2. 2. 4 RT-PCR反应条件:500C反应30min (合成第一链cDNA);940C反应2min(变性); 940C 0.5 min, 520C 0.5 min, 720C 1 min，33个循环;720C反应10min刊。C反应1mino B.2.2.5 同时作阳性和阴性对照。SN/T 1875-2007 B.2.2.6 琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物:RT-PCR反应结束后，取10L扩增产物以及DNAMarker，进行2%琼脂糖凝胶电泳(含澳化乙链o.5g/mL) ，置紫外灯下肉
14、眼观察结果或凝胶成像系统成像。B. 2. 3 结果判定电泳带清晰且大小与标准分子量对!照，出现200bp条带判定为阳性，否则为阴性。7 SN/T 1875-2007 C.1 电镜检测C.1.1 材料与试剂材料与试剂包括:附录C(资料性附录)轮状病毒检测方法压舱水浓缩液O.2 mLO. 5 mL; 铜网(直径约为2mm3 mm)，每网为200目;支持膜(以0.25%聚乙烯醇缩甲醒膜和0.5%火面胶膜制备铜网上的支持膜，干燥后，喷镀薄薄一层碳膜，备用); 血清:兔抗RV诊断血清，其效价1: 64 (对流免疫电泳)以上，用时以生理盐水作1: 20 1 : 50稀释;染色液:2.5%磷鸪酸。C. 1.
15、2 操作步骤C. 1. 2.1 取压舱水浓缩液约O.2 mLO. 5 mL C. 1. 2. 2 用微量吸液器滴入有支持膜的铜网上，1min2 min后，用滤纸轻轻吸走铜网上的液体。C. 1. 2. 3 用染液染1分钟，吸走多余染液，干燥后电镜观察。C. 1. 2. 4 干燥后上电镜观察。形态学平均直径70口m，在40口m45口m的六角形核心之外，可以清楚的分辨出一个呈放射型亚单位构成的内壳和薄而光滑的外壳为阳性。C.2 单管半套式RT-PCR法检测轮状病毒(RV)C. 2.1 材料与试剂材料与试剂包括:压舱水浓缩液;RJA提取试剂盒;RT-PCR检测试剂盒;1.4%琼脂糖凝胶;O. 5g/m
16、L漠化乙链;以轮状病毒VP7基因的高保守区段设计各血清型通用的引物，碱基序列分别为:Pj : 5 GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3; P2 : 5 -GTATGGTATTGAATATAC CAC-3 ;P, : 5 -GATCCTGTTGGCCATCC-3 , ;其中，Pj和良为半套式PCR外引物对，矶和1为半套式PCR内引物对，所对应的碱基位置分别为128， 51 71， 376392 0 C. 2. 2 操作步骤:C. 2. 2.1 用RJA提取试剂盒提取样品轮状病毒的总RNA。C.2.2.2 将轮状病毒RNA模板进行梯度稀释后，分别做RT-PCR和单管半套式R
17、T-PCR扩增。C. 2. 2. 3 RT-PCR的反应体系(25L):2.5LlO X PCR buffer，200mol/L dNTP , 20 U RJasinPj、良各O.3mol/L，MLV 200 U , TaqE 1. 5 U，RJA模板2.5Lo C.2.2.4 第二步PCR反应液加在反应管内，包括2.5L 10 X PCR buffer, 200mol/L的dJTP，P2、1各O.5mol/L， Taq E 1. 5 U。C.2.2.5 第一步RT-PCR扩增条件:50C30 min合成第一链cDNA;然后94C变性5mi川940C40s，SN/T 1875-2007 550
18、C 50 s , 720C 40 s，循环30次;720C7 mi口，以确保扩增产物充分延伸。C.2.2.6 以大于8000g的转速离心15s，使悬浮于反应管盖内的第二次PCR反应混合液同前面的扩增反应物混匀，再次扩增，条件同上。C.2.2.7 同时作阳性和阴性对照。C.2.2.8 取两次扩增产物5L，用1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。C. 2. 3 结果判定在凝胶成像系统中观察结果，与100bp标准分子量对照，两次PCR分别出现392bp和342bp的条带即为阳性结果。注将反转录和两次扩增反应的所需试剂一次性加入反应管内.3次反应在一个反应管内完成，整个实验过程无须开盖。而第二次扩增所需的引物
19、和试剂置于反应管管帽内，利用表面张力的作用悬浮在反应管上方.RT和第一次扩增完成后，以离心的方法使悬漓和下面的反应液混合，再次扩增，即可完成半套式反应。9 khCON-mh-问Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准入出境船舶E舱水微生物学检测规程SN/T 1875-2007 -兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷-兴开本880X12301/16 印张I字数15千字2007年6月第一版2007年6月第一次印刷印数1-2000 定价10.00元当咛书号:155066.2-17804 SN/T 1875-2007
